学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

犬华支睾吸虫病诊断试剂盒的研制

作　者: 陈爱华
导　师: 王春仁
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 华支睾吸虫病磷酸甘油激酶 28ku谷胱甘肽S-转移酶间接ELISA 试剂盒犬
分类号: S858.292
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 21次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

华支睾吸虫病(Clonorchiais sinensis)是由华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)寄生于犬、猫等多种动物和人肝脏、胆囊内而引起的一种以肝胆病变为主要特征的人兽共患寄生虫病,也称肝吸虫病。华支睾吸虫病主要分布于亚洲的中国、韩国、越南和日本等国家,随着移民的迁徙,该病也出现在欧洲一些国家。该病在我国流行十分广泛,广东、广西、黑龙江等27个省(自治区)、市有该病的报道,全球估计有华支睾吸虫病人和感染者3500万,其中中国感染者达到1500万。人和动物感染后,引起肝脏、胆道的一系列病理变化,表现为胆管炎、胆管上皮增生、胆囊炎和胆结石等,重者可发生肝硬化、胆管上皮癌和肝细胞癌,该病为中国目前重点防治的寄生虫病之一。华支睾吸虫病的早期准确诊断,不但能够减少经济损失,而且可以有效地控制该病的发生和蔓延,具有长远的社会效益。犬华支睾吸虫病传统诊断方法为虫卵检查,检出率较低,血清学检查的应用也比较少,而且虫体抗原制备困难。因此,本试验拟以华支睾吸虫的磷酸甘油激酶(PGK)和谷胱甘肽S转移酶(28Ku GST)重组蛋白为抗原建立间接ELISA诊断方法,从而研制诊断试剂盒用于犬华支睾吸虫病的诊断。本试验根据GenBankTM上发表的华支睾吸虫PGK(CsPGK)与28KuGST序列,分别设计合成一对引物,以提取的犬源华支睾吸虫总RNA为模板,PT-PCR方法扩增CsPGK与Cs28GST基因,连接pMD18-T载体并转化到TG1宿主菌中,经鉴定及序列分析,获得阳性克隆。阳性质粒pMD18-T-CsPGK与pMD18-T-28CsGST和表达载体pET-30a(+),经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后回收、连接、转化到TG1宿主菌,提取质粒,酶切鉴定正确后,阳性质粒转化到最佳宿主菌BL21(DE3)中,构建其原核重组表达载体pET-30a-CsPGK与pET-30a-Cs28GST。经酶切鉴定证实,构建的重组质粒pET-30a-CsPGK与pET-30a-Cs28GST中含有CsPGK与Cs28GST基因,且基因序列和阅读框架均正确。将重组菌株pET-30a- CsPGK/ BL21和pET-30a-Cs28GST/ BL21用1mmol/L IPTG诱导,融合蛋白CsPGK与Cs28GST获得高效表达。经Western blot检测,重组菌株表达的融合蛋白能够被华支睾吸虫特异性抗体所识别。以纯化的重组蛋白CsPGK和Cs28GST组合“鸡尾酒”式的混合抗原包被酶标板,通过对间接ELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件为:抗原的最佳包被液为50mM pH9.6的碳酸盐缓冲液;“鸡尾酒”抗原最适比例为VCsPGK:VCs28GST为3:2(CsPGK的浓度为3.0μg/mL、Cs28GST的浓度为1.0μg/mL);最佳封闭液为5%脱脂奶粉,封闭条件为37℃1 h;最佳血清稀释液为5%脱脂奶粉加2.5% Escherichia coli裂解液,血清稀释倍数为10倍,最佳作用时间为37℃1h;HRP-兔抗狗IgG的最适工作浓度为1:2 000,二抗工作时间为37℃1 h。采用已确立的间接ELISA反应条件,对109份阴性血清(经粪检与剖检证实)的检测结果进行统计学分析,确定了间接ELISA方法阴阳血清的判定标准,即OD450值大于等于0.3为阳性,小于0.3为阴性。板内、板间检测血清的变异系数小于10%。应用建立的间接ELISA方法对109份阴性血清和87份阳性血清(经粪便检测和剖杀检测证实)的检测结果表明,ELISA方法的特异性为95.1%,敏感性93.1%,与犬弓首蛔虫、旋毛形线虫、泡状带绦虫和弓形虫阳性血清均无交叉反应。在此基础上,将成熟的ELISA技术试剂盒化,本试剂盒可操作性强,不需要配制额外试剂,2个半小时左右即可出结果,在4℃条件下可保存半年以上。用研制的试剂盒对205份临床样品的IgG抗体水平,结果血清抗体阳性率为16.8%,说明了本试剂盒准确客观地反映实际情况,进一步证明了本试剂盒的研制是成功的。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章绪论  10-24
  1.1 华支睾吸虫的研究进展  10-12
  1.2 华支睾吸虫病的研究进展  12-19
  1.3 华支睾吸虫抗原的研究进展  19-23
  1.4 研究的目的和意义  23-24
第二章材料与方法  24-36
  2.1 材料  24-25
  2.2 方法  25-36
第三章结果  36-54
  3.1 CsPGK 和 Cs28GST 基因的克隆  36-39
  3.2 CsPGK 和 Cs28GST 基因的表达  39-43
  3.3 间接 ELISA 方法的建立及试剂盒的组装  43-51
  3.4 临床样本检测  51-52
  3.5 试剂盒的初步组装  52-54
第四章讨论  54-58
  4.1 抗原和载体的选择  54
  4.2 重组蛋白的纯化  54-55
  4.3 间接 ELISA 方法的建立  55-56
  4.4 与其它公司试剂盒以及其它方法的比较试验  56
  4.5 试剂盒的应用  56-58
第五章结论  58-59
参考文献  59-66
致谢  66-67
附录  67-77
作者简历  77

犬华支睾吸虫病诊断试剂盒的研制

内容摘要

全文目录

相似论文