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基因免疫制备抗甲型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体

作 者: 孙恩成
导 师: 朴范泽;刘明
学 校: 黑龙江八一农垦大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 甲型禽流感病毒 核蛋白 生物信息分析 基因免疫 单克隆抗体
分类号: S855.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


高致病性禽流感是由正黏病毒科A型禽流感病毒引起,具有很强的传染性和极高的死亡率。世界卫生组织等其他机构密切监控流感病毒的流行性以及其引起的疾病的毒力和传播途径的改变,为有效预测下一次大流感的流行打下了基础。不过,一种针对于所有A型禽流感病毒快速有效的诊断和监控方法的建立将对该病毒病的有效控制产生重要作用。本实验从送检的鸭组织病料中分离到1株H5N1亚型禽流感病毒,经序列测定发现HA蛋白裂解位点上插入多个连续的碱性氨基酸(-PQREIRRKKR*G-),从分子上证实是一株高致病性禽流感病毒(HPAIV)。经过HA、NA基因生物信息分析发现其潜在的糖基化位点与笔者所选参比毒株一致,未发生突变;遗传进化分析得知A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1)可能是该毒株的来源株,并将其命名为A/Duck/HeiLongJiang/LZG/2006(H5N1)。以该病毒全基因组RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增出NP基因,并将其克隆到pCI-neo真核表达载体中,成功构建重组表达质粒pCI-NP,瞬时转染Vero细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)和蛋白免疫印迹(Western blot,WB)试验证明重组载体的NP基因能够在哺乳动物细胞中有效瞬时表达并具有良好的生物学活性。将重组质粒分三次免疫6周龄雌性BALB/c小鼠后, ELISA试验结果显示该重组质粒能够诱导小鼠产生较高的抗NP蛋白的抗体,为下一步实验打下坚实的基础。利用上述免疫小鼠脾细胞结合杂交瘤细胞融合技术,以纯化H5N3亚型禽流感重组病毒为包被抗原进行ELISA检测,获得六株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1C4、2H12、4E5、6B2、6F2、9D1。Western bolt分析显示该六株单克隆抗体均与AIV H5N3亚型的核蛋白发生反应,于56 Ku处有明显条带。特异性实验表明,该六株单克隆抗体仅与禽流感病毒反应,与禽类其它相关病毒不反应。其中6B2具有很好的反应谱系与A型禽流感病毒H1~H15亚型均有较好的反应性。通过临床分离株(H5、H7和H9亚型)的检测试验亦表明6B2具有重要的临床应用价值。

全文目录


中文摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章 文献综述  7-17
  1.1 禽流感病毒简介  7-11
  1.2 A 型流感病毒核蛋白(NP)简介  11-16
  1.3 本研究目的和意义  16-17
第二章 病毒分离及HA、NA 基因生物信息分析  17-24
  2.1 材料与方法  17-18
  2.2 结果  18-22
  2.3 讨论  22-24
第三章 A 型禽流感病毒NP 基因真核表达载体的构建及免疫  24-31
  3.1 材料与方法  24-26
  3.2 结果  26-29
  3.3 讨论  29-31
第四章 抗A 型禽流感病毒核蛋白单克隆抗体的制备  31-44
  4.1 材料与方法  31-36
  4.2 结果  36-41
  4.3 讨论  41-44
第五章 结论  44-45
参考文献  45-50
附录  50-54
致谢  54-55
作者简历  55

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医传染病学 > 病毒病
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