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产氢产乙酸互营共培养体的选育及其应用基础研究

作　者: 孙倩
导　师: 李建政
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 微生物学
关键词: 产氢产乙酸菌互营共培养体 PCR-DGGE 生物强化
分类号: Q93-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 88次
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内容摘要

传统观点认为,产甲烷作用是厌氧消化过程的限速步骤。然而,前期研究发现,产氢产乙酸菌群的生态幅要比产甲烷菌更加狭窄,对环境的变化更加敏感,其代谢强度直接决定了产甲烷菌群的增殖和代谢能力,因此提出了“产氢产乙酸菌群的产氢产乙酸作用是厌氧消化的第一限速步骤”这一学术观点。产氢产乙酸菌的分离纯化非常困难,其研究进展缓慢,目前获得的纯培养物只有少数几个。种子资源的匮乏,极大限制了基于强化产氢产乙酸作用的高效厌氧生物处理技术的研发。基于以上认识和研究现状,本论文开展了产氢产乙酸互营共培养体的分离筛选工作,并以此为基础,对所筛选的共培养体进行了生理生态特性研究,并进一步探索了以其强化厌氧生物处理系统效能的可行性。论文利用基质选择作用,通过选择培养基的传代培养和代时控制以及培养条件的优化,最终选育到7号和8号两个产氢产乙酸菌互营共培养体。在含有丙酸钠和丁酸钠各10 g/L的培养基中,经过30 d的培养,7号和8号互营共培养体的乙酸产量分别达到2485 mg/L和3362 mg/L,产氢率分别达到549.06 mL/L-culture和456.57 mL/L-culture。通过PCR-DGGE分子检测手段,分析了7号和8号两个互营共培养体的种群结构。在PCR-DGGE图谱中,7号培养物显示出4个条带,8号则呈现出5个条带,而且两个共培养体中有重叠条带,说明这两个培养物均为微生物的混合培养物。将扩增得到的所有16SrDNA序列测序,并构建了系统发育树,发现两个共培养体中都包含有专性产氢产乙酸菌Syntrophospora bryantiii和专性的互营产乙酸菌Desulfotomaculum sp.,除此之外还有伴生菌,如能利用甲酸盐和H2/CO2的Uncultured bacterium和Sedimentibacter sp.等。生态因子对7号和8号两个互营共培养体的生长和产氢产乙酸特性研究表明,以丁酸作为碳源(10 g/L)、胰蛋白胨和酵母膏作为氮源时,7号共培养体在35℃、初始pH 7的条件下,具有最佳的生长和产氢产乙酸能力;8号共培养体则在45℃、初始pH 7.5时具有最大的生长和产氢产乙酸能力。摇瓶发酵试验结果表明,7号和8号两个互营共培养体是开发厌氧发酵系统生物强化技术的良好种子资源。取自发酵制氢反应系统的污泥,在投加7号共培养体后,其氢气产量和氢气产生速率分别可提高1.15倍和1.24倍;取自厌氧废水处理系统的污泥,在投加8号共培养体后,其底物转化率和甲烷产生速率可分别提高1.35倍和1.76倍。初步证明了以产氢产乙酸菌互营共培养体强化厌氧生物处理系统效能的可行性。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第1章绪论  11-25
  1.1 废水的厌氧生物处理技术的研究进展  11-14
    1.1.1 概述  11
    1.1.2 厌氧生物处理技术的发展历史和研究进展  11-12
    1.1.3 厌氧生物处理系统中的微生物群落及其作用  12-13
    1.1.4 厌氧消化系统的微生物生态学研究现状  13-14
  1.2 产氢产乙酸细菌的发现及其研究进展  14-17
    1.2.1 产氢产乙酸细菌的发现  14-15
    1.2.2 互营联合培养概念的提出  15
    1.2.3 产氢产乙酸细菌的纯培养  15-16
    1.2.4 产氢产乙酸细菌的国内外研究现状  16-17
  1.3 产氢产乙酸细菌的特性  17-20
    1.3.1 产氢产乙酸细菌的生理学特性  17-18
    1.3.2 互营共生特性  18-20
    1.3.3 共培养体的筛选  20
  1.4 生物强化技术在废水处理中的应用  20-23
    1.4.1 生物强化技术的提出  20-21
    1.4.2 废水生物处理生物强化技术及其研究现状  21-23
  1.5 研究内容及技术路线  23-25
    1.5.1 课题来源及研究意义  23
    1.5.2 主要研究内容与技术路线  23-25
第2章试验装置、材料与方法  25-40
  2.1 试验装置  25-26
    2.1.1 产氢产乙酸菌的富集  25
    2.1.2 产氢产乙酸互营共培养体的选育  25-26
    2.1.3 生物强化试验  26
    2.1.4 其他仪器与设备  26
  2.2 厌氧操作实验  26-28
    2.2.1 改良Hungater滚管操作  26-27
    2.2.2 厌氧管斜面法操作  27-28
    2.2.3 平板培养瓶厌氧操作  28
  2.3 试验材料  28-31
    2.3.1 初始菌群  28-29
    2.3.2 培养基  29-31
  2.4 分析项目与方法  31-33
    2.4.1 常规分析项目  31
    2.4.2 发酵气体成分及含量的测定  31-32
    2.4.3 液相末端发酵产物的测定  32
    2.4.4 苯甲酸含量的测定  32-33
  2.5 生物相观察与分析  33-34
    2.5.1 菌液OD值的测定  33
    2.5.2 荧光显微镜观察  33-34
    2.5.3 电子显微镜(SEM) 扫描观察  34
    2.5.4 光学显微镜观察  34
  2.6 分子生物学分析项目与方法  34-40
    2.6.1 基因组DNA的提取及其PCR  34-36
    2.6.2 变性梯度凝胶电泳（DGGE）菌落结构分析  36-39
    2.6.3 16S rDNA基因序列的系统进化分析  39-40
第3章产氢产乙酸互营共培养体的选育  40-50
  3.1 产氢产乙酸互营共培养体的分离策略  40-43
    3.1.1 培养基的设计  40-41
    3.1.2 富集筛选及代时控制  41-42
    3.1.3 分离筛选  42
    3.1.4 分离筛选技术的探讨  42-43
  3.2 产氢产乙酸优势互营共培养体的筛选  43-45
    3.2.1 产氢产乙酸菌互营共培养体富集物的获得  43-44
    3.2.2 产氢产乙酸菌互营共培养体的获得  44
    3.2.3 产氢产乙酸菌互营共培养体的优选  44-45
  3.3 互营共培养体的生物相观察  45-46
  3.4 产氢产乙酸互营共培养体菌群结构解析  46-48
    3.4.1 PCR-DGGE图谱及其分析  46-47
    3.4.2 系统发育树的构建  47-48
  3.5 本章小结  48-50
第4章产氢产乙酸互营共培养体生理生态特性研究  50-70
  4.1 产氢产乙酸互营共培养体的营养特性  50-57
    4.1.1 碳源利用特性  50-53
    4.1.2 氮源对产氢产乙酸共培养体生长的影响  53-57
  4.2 生态因子对产氢产乙酸互营共培养体的影响  57-64
    4.2.1 底物浓度对共培养体生长和产氢产乙酸特性的影响  57-59
    4.2.2 温度对互营共培养体生长和产氢产乙酸能力的影响  59-61
    4.2.3 初始pH对共培养体生长和产氢产乙酸特性的影响  61-64
  4.3 产氢产乙酸共培养体对厌氧生物反应系统的强化作用  64-69
    4.3.1 产氢产乙酸互营共培养体对发酵生物制氢系统的强化作用  64-66
    4.3.2 产氢产乙酸互营共培养体对废水厌氧处理系统的强化作用  66-69
  4.4 本章小结  69-70
结论  70-71
参考文献  71-77
攻读学位期间发表的学术论文及其他成果  77-79
致谢  79

产氢产乙酸互营共培养体的选育及其应用基础研究

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