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致病性霍乱弧菌特异性基因序列三重TaqMan实时定量PCR快速检测体系的建立

作　者: 杨辉
导　师: 蔡剑平
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 临床检验与诊断学
关键词: 产毒型霍乱弧菌 01群霍乱弧菌 0139群霍乱弧菌 TaqMan探针聚合酶链式反应霍乱毒素
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的建立针对产毒性01群及0139群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光三重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系。探讨该体系对临床模拟标本检测的意义,为该体系的临床应用提供可靠的技术依据。方法根据01群霍乱弧菌主基因组0抗原编码基因rfb-01、0139群霍乱弧菌主基因组0抗原编码基因rfb-0139和霍乱肠毒素的A亚基编码基因ctxA的特异性序列设计引物及TaqMan探针,构建各个目的靶序列的重组质粒,制备浓度为1.0×10¹⁰～1.0×10^-1拷贝/ul的质粒梯度稀释模板,并将01群和0139群霍乱弧菌基因组DNA分别梯度稀释至1×10⁵pg到1×10^-3pg,利用便携式Smart cyclerⅡ实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性。将01群霍乱弧菌灭活菌株悬液[1.0×10¹¹CFU（菌落形成单位）/ml]连续10倍稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成5.0×10¹～5.0×10⁹CFU/g梯度浓度的模拟带菌者粪便标本,将0139群霍乱弧菌灭活菌株悬液[1.0×10¹⁰CFU（菌落形成单位）/ml]连续10倍稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成5.0×10¹～5.0×10⁸CFU/g梯度浓度的模拟带菌者粪便标本,提取DNA,用以评价产毒型01群及01 39群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR法对临床模拟标本检测的灵敏度、特异性和稳定性。结果实时荧光三重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系对重组质粒的检测敏感度为1.0×10²拷贝每反应体系:对01群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1.0×10^-1pg每反应体系;对0139群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1.0×10^-1pg每反应体系;该实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系对01群霍乱弧菌或0139群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测敏感度均为1.0×10³CFU每反应体系,亦相当于模拟带菌者粪便标本5.0×10⁴CFU/g;对不同含菌量的模拟带菌者粪便标本的三次重复实验结果显示,各靶序列扩增反应CT值的检测变异系数均小于5%;对新鲜健康成人粪便标本的检测未见明确的异常扩增。该检测体系在检测19种与霍乱弧菌具有相同生活环境的细菌时不存在非特异性扩增;在特异性评价中,3名健康成人新鲜粪便标本的阴性对照均未见异常扩增曲线。整个反应在3个小时内完成。结论该研究建立的实时荧光三重TaqMan聚合酶链式反应检测体系可作为粪便中01群或0139群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力。

全文目录

中英文缩略词表  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-12
材料与方法  12-26
结果  26-60
讨论  60-65
结论  65-66
参考文献  66-68
文献综述  68-82
致谢  82

致病性霍乱弧菌特异性基因序列三重TaqMan实时定量PCR快速检测体系的建立

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