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人血管性血友病因子A1区单克隆抗体的制备和应用研究
作 者: 沈飞
导 师: 梁中琴
学 校: 苏州大学
专 业: 药理学
关键词: 人血管性血友病因子A1区 单克隆抗体 杂交瘤 血小板黏附 血小板聚集
分类号: R96
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
下 载: 23次
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内容摘要
血管性血友病因子(Von Willebrand Factor, VWF)是一种重要的血浆糖蛋白,是血栓形成过程中的一个重要相关蛋白,由血管内皮细胞合成,贮存于Weible-Palade小体内,骨髓巨核细胞也合成VWF,贮存在血小板α颗粒内的。正常人血浆VWF浓度约为10mg/L。VWF基因位于第12号染色体,长178kb,由52个外显子与51个内含子组成。VWF分子包含4个不同的功能结构域,其排列为NH2-D1-D2-D′-D3-A1-A2- A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-COOH。A1区为血小板膜糖蛋白(Gp)Ib结合部位,A3区为胶原结合部位,C1区为血小板GpIIb/IIIa结合部位,D′区为因子Ⅷ结合部位。其中A1区是瑞斯托霉素(Ristocetin)、博托霉素(Botrocetin)的结合位点,也是肝素、Ⅵ型胶原的结合位点,是VWF与血小板结合的关键部位。VWF多聚体是起着连接血小板和内皮下基质的桥梁作用,通过内皮下基质胶原同VWF-A3区的结合,以及GpIbα同VWF-A1区的结合。VWF同血小板平时共存于循环血液中,不发生相互作用,当血管内皮细胞受到损伤时-如外源性分子,蛇毒蛋白博托霉素的作用-内皮下胶原等细胞外基质暴露,与血液中VWF-A3区结合,使VWF构型发生改变,或者在高剪切力条件下VWF构型发生改变,暴露了与血小板GpIb结合的位点,即VWF-A1区,从而使血小板不断附着在受损血管壁部位,黏附的血小板或受到血小板激活剂(如胶原、凝血酶等)作用的血小板会发生一系列反应,包括花生四烯酸代谢,产生血栓烷A2(TXA2)和释放出细胞内颗粒内容物(ADP等),最后导致血小板GpIIb/IIIa复合物的构型改变,形成粘附分子受体,并通过与纤维蛋白原的结合而使血小板之间相互黏附、聚集成团,在血管破损处形成早期血栓。血栓性疾病一直就是危害人类健康的重要疾病之一,抗血栓治疗近年来也取得了巨大的进步,主要是抗血小板GpIIb/IIIa药物的出现,如ReoPro,此类药物作用于血小板聚集的最终途径,抑制血小板GpIIb/IIIa同纤维蛋白原的结合,从而阻止血栓的形成,但是这类药物的缺点也很突出,就是直接抑制了血小板的聚集,这样的结果就是会产生较高的出血倾向。2002年,Science杂志发表了GpIbα同VWF-A1区复合物结构一文,明确了GpIbα同VWF-A1区结合位点,指出了这一结合位点对血小板黏附的影响,对今后开发新型抗血栓药物提供了新思路。因此抗VWF-A1区单抗的研制将对血小板黏附的机理研究,血栓形成早期的机理研究以及抗血栓药物的研制提供有力的工具。我们用自己构建的VWF-A1区表达载体,诱导表达VWF-A1区原核蛋白,经Ni-NTA Agarose凝胶柱纯化,将rVWF-A1作为抗原,免疫Balb/c小鼠,经杂交瘤技术获得了三株抗人VWF-A1区单克隆抗体,分别命名为SZ-129、SZ-130、SZ-131。琼脂糖双扩散鉴定三株单抗均为IgG1亚类;ELISA法测定其腹水效价分别约为1×10-5、2×10-5、5×10-5;经Protein G-Sepharose 4B亲和层析柱纯化所得的抗体浓度分别为2mg/ml、1.26mg/ml、2.38mg/ml。ELISA和Western blot显示SZ-129、SZ-130和SZ-131都能与原核表达的rVWF-A1和纯化的人血浆VWF蛋白特异结合;免疫细胞化学实验也证实,SZ-129和SZ-130都能特异的结合内皮细胞中的VWF;血小板聚集试验显示,SZ-129和SZ-130能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集,并且该抑制具有一定的量效关系。SZ-129能抑制博托霉素诱导的血小板聚集;SZ-129和SZ-130都不能抑制ADP和胶原诱导的血小板聚集。而VWF同GpIb结合抑制实验表明,SZ-129和SZ-130作用于VWF后,抑制了VWF同血小板GpIbα的结合;流动小室实验表明,SZ-129作用于VWF后,抑制了VWF同血小板的结合,减少了血小板在固相化VWF上的黏附。以上试验初步显示,SZ-129、SZ-130、SZ-131作用于VWF-A1区,SZ-129和SZ-130能抑制VWF与血小板GpIb的结合,特别是SZ-129,在体外能减少血小板黏附于VWF,通过改造,具有成为抗血小板黏附,甚至是抗血栓药物的可能。VWF上的各个结构域具备的结合活性目前基本已经明确,如今VWF的研究热点是胶原-VWF-GpIb轴,抑制胶原同VWF的结合,或者抑制VWF同GpIb的结合,都能较好的抑制血小板黏附,从而阻碍血小板聚集,减少血栓的形成。我们把目标放在VWF-A1区,通过研制新的抗VWF-A1区单克隆抗体,希望能找到抑制VWF同GpIb结合的单抗,为今后新型抗血栓药物的研制提供一个良好的工具。
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全文目录
中文摘要 3-5 Abstract 5-9 引言 9-15 第一部分 人血管性血友病因子A1 区原核蛋白的表达和鉴定 15-21 第一章 人血管性血友病因子A1 区原核蛋白的设计合成 15-18 第二章 人血管性血友病因子A1 区原核蛋白的鉴定 18-21 第二部分 抗人血管性血友病因子A1 区单克隆抗体的制备和鉴定 21-30 第一章 抗人血管性血友病因子A1 区单克隆抗体的制备 21-25 第二章 抗人血管性血友病因子A1 区单克隆抗体的鉴定 25-30 第三部分 抗人血管性血友病因子A1 区单克隆抗体的应用研究 30-39 第一章 抗人血管性血友病因子A1 区单克隆抗体在血小板聚集中的作用 30-35 第二章 抗人血管性血友病因子A1 区单克隆抗体在血小板黏附中的作用 35-39 结论 39-40 参考文献 40-46 综述 抗血小板黏附药物研究进展 46-53 攻读学位期间公开发表的论文 53-54 致谢 54
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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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