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猪附红细胞体病实验动物感染模型的建立及防治技术的研究

作　者: 赵现锋
导　师: 杜爱芳
学　校: 浙江大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪附红细胞体实验动物感染模型中草药药效试验猪附红细胞体病蜂胶灭活疫苗免疫试验
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

附红细胞体病(Eperythrozoonsis, EHS)是由附红细胞体(Eperythrozoon, EH)寄生于红细胞表面及血浆中引起的一种人畜共患病。该病在人和动物上多为隐性感染,临床急性发病以黄疸、高热、贫血等为特征,多发生在夏秋季节,呈散发或地方流行性。严重威胁着畜牧业的发展和人类健康。目前已经造成了巨大的经济损失,并呈范围扩大趋势,因而引起国内外学者的广泛关注。近年来关于附红细胞体病的研究主要集中在病原学、诊断方法和治疗等方面,而关于大量病原的获取、中草药防治、免疫预防等方面的研究甚少。基于上述考虑,本研究通过猪附红细胞体(Mycoplasma suis, M. suis)纯化病原感染实验动物建立模型,获取大量病原,为附红细胞体的相关研究提供基础；选择几种中草药进行体外药效试验,筛选出对M. suis有良好抑杀效果的药物,为该病的治疗提供一种新的思路和方法；选用蜂胶作为佐剂包被M. suis纯化病原制成猪附红细胞体蜂胶灭活疫苗,接种小鼠,观察疫苗的免疫保护效果,为该病的预防提供一种新的途径。目前,关于附红细胞体的体外培养技术还不成熟,所以很难快速、低廉地获取大量病原,一定程度上制约了其生物学特性、诊断方法、致病机理、流行病学、分子生物学和免疫预防等方面的研究。本研究从经镜检和PCR诊断为阳性的猪抗凝血中纯化M. suis,选用0.25ml／只、0.50ml／只和0.75ml／只三种剂量分别经肌肉、腹腔、静脉三种方式接种小鼠,通过观察小鼠的临床症状,血液中附红细胞体的首现期、高峰期和消失期,测定小鼠血液常规等,研究最佳感染途径和感染剂量及该病原在小鼠体内的消长规律。结果表明,采用高剂量静脉接种的小鼠血液中最早查到M. suis,且感染强度最强,临床症状和血液常规变化最为典型。说明可以利用小鼠建立M. suis实验动物感染模型。这与其他学者的相关报道结果基本一致。为今后获取大量病原提供了一种新的途径。为筛选出对M. suis有抑杀效果的中草药及药物作用浓度,利用本实验室已经初步建立的M. suis体外培养体系,选用野菊花、苦参、常山、青蒿素等四种毒副作用小对原虫有较好疗效的中药,对M. suis进行体外药效试验。以RPMI1640为基础培养液,加入40%猪血清,添加三种药液的浓度,分别为1.25mg／ml、2.5mg／ml和5mg/ml,在5%CO237℃条件下培养,观察不同时间药物对M. suis的作用效果。结果表明,四种中药对Msuis均有明显的抑杀效果,其中5mg／ml常山药液效果最好；5mg／ml的青蒿素次之；野菊花和苦参稍差。本文为首次报道野菊花、苦参、常山、青蒿素等四种中草药对M. suis具有较强的体外抑制和杀灭作用。利用本实验室制备的M. suis蜂胶灭活疫苗免疫小鼠。以0.1ml／只、0.3ml／只、0.6ml／只三种剂量肌肉接种小鼠,免疫两次,间隔14d。二免后14d、28d、42d、56d,分别测定其体液免疫和细胞免疫效果。二免后56d,对小鼠腹腔接种M. suis纯化病原,进行攻毒保护试验,观察小鼠的临床症状、血液感染情况及死亡率。结果表明：小鼠血清特异性IgG抗体在二免后14d开始升高,之后维持在一个较高的水平直到试验结束(二免后56d)。脾淋巴细胞转化试验表明,二免后14d和28d,各免疫组对ConA有显著反应性(P<0.05)；二免后28d,低、中剂量组对LPS的反应性显著高于高剂量免疫组(P<0.05)；对M. suis抗原的反应性随实验时间推移逐渐增强,各免疫组均显著高于对照组(P<0.05)。攻毒试验表明,各免疫组保护率均达到90%以上。说明该疫苗可诱导机体产生较好的体液免疫和细胞免疫效果,且免疫保护率达到90%以上。本文为首次报道利用蜂胶作为佐剂包被M. suis纯化病原制成灭活疫苗。研究为猪附红细胞体病的预防提供了一种新的途径,也为该疫苗的推广应用提供了科学依据。本研究对猪附红细胞体病的实验动物感染模型、中草药体外药效试验效果以及Msuis蜂胶疫苗免疫效果进行了初步研究,建立了实验动物感染模型,筛选出野菊花、苦参、常山、青蒿素等四种对M. suis有显著杀灭效果的中草药,制备了以蜂胶作为佐剂、M. suis纯化病原为抗原的灭活疫苗。

全文目录

中文摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-13
第一部分文献综述  13-31
  第一章动物附红细胞体病病原学研究进展  14-18
    1 病原学分类  14-15
    2 形态  15
    3 大小  15
    4 结构  15-16
    5 染色特征  16
    6 运动性  16
    7 生活史繁殖方式  16-17
    8 宿主特异性  17
    9 生物学性质  17-18
  第二章动物附红细胞体病的诊断方法研究进展  18-22
    1 临床症状观察  18-19
    2 病理变化观察  19
    3 血液学检查  19-20
    4 血清学诊断方法  20
    5 分子生物学方法  20-22
  第三章动物附红细胞体病动物感染模型的建立研究进展  22-24
    1 利用本动物感染  22-23
    2 利用实验动物感染  23-24
  第四章动物附红细胞体病的防治技术研究进展  24-26
    1 药物治疗  24-25
    2 接种疫苗  25
    3 预防措施  25-26
  参考文献  26-31
第二部分研究内容  31-32
第一章猪附红细胞体病实验动物感染模型的建立  32-44
  摘要  32
  1 材料与方法  32-35
  2 结果  35-39
    2.1 小鼠状况  35
    2.2 人工感染试验结果  35
    2.3 附红细胞体形态特征  35-37
    2.4 小鼠血液常规测定  37-39
  3 讨论  39-41
    3.1 小鼠状况  39
    3.2 血液中附红细胞体的消长规律  39-40
    3.3 附红细胞体形态特征  40
    3.4 小鼠血液常规测定  40-41
  参考文献  41-44
第二章中草药对猪附红细胞体的体外药效试验  44-53
  摘要  44
  1 材料与方法  44-47
  2 结果  47-48
    2.1 四种药物浓度为1.25mg/ml时对猪附红细胞体的体外药效试验结果  47-48
  3 讨论  48-51
    3.1 野菊花对猪附红细胞体的体外抑杀效果  48-49
    3.2 苦参对猪附红细胞体的体外抑杀效果  49
    3.3 常山对猪附红细胞体的体外抑杀效果  49-50
    3.4 青蒿素对猪附红细胞体的体外抑杀效果  50-51
  参考文献  51-53
第三章猪附红细胞体蜂胶灭活疫苗的研制及免疫保护效果的研究  53-66
  摘要  53
  1 材料与方法  53-57
  2 结果  57-61
    2.1 疫苗的物理性状检验  57
    2.2 无菌检验  57
    2.3 安全性检查  57
    2.4 保存期试验  57
    2.5 二免后不同时间小鼠血清特异性IgG抗体水平  57-59
    2.6 M.suis蜂胶疫苗免疫后小鼠脾淋巴细胞转化效果  59-61
    2.7 攻毒保护试验结果  61
  3 讨论  61-64
    3.1 疫苗的安全性  61
    3.2 蜂胶作为佐剂的优点  61-62
    3.3 蜂胶疫苗的特点  62-63
    3.4 M.suis蜂胶疫苗免疫后体液免疫血清特异性IgG抗体水平变化  63
    3.5 M.suis蜂胶疫苗免疫后小鼠脾淋巴细胞对ConA和LPS的反应性增强  63-64
    3.6 M.suis蜂胶疫苗免疫后小鼠脾淋巴细胞对 M.suis的反应性增强  64
    3.7 免疫保护性  64
  参考文献  64-66
结论  66-67
附录A 溶液配制  67-69
附录B 英文缩写注释  69-70
致谢  70

猪附红细胞体病实验动物感染模型的建立及防治技术的研究

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