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副结核病DNA疫苗的构建及其免疫效果评价

作　者: 王聃
导　师: 张守发
学　校: 延边大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 副结核病 融合DNA疫苗 免疫效果
分类号: S855.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 19次
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内容摘要


副结核病是主要由禽分枝杆菌副结核亚种引起的一种慢性消耗性疾病,在许多国家尤其是发展中国家仍广泛流行,该病给畜牧业造成了巨大的经济损失。因此,控制副结核病的意义重大,然而,至今仍没有一种疫苗可用于该病的预防。本研究利用PCR技术,以本实验室构建好的重组质粒pET32a-0862-2154c和pET32a-2751-2762c为模板扩增出map0862-2154c和map2751-2762c,连接到真核表达载体pCDNA3.1(+)中,构建了真核重组质粒pCDNA-map0862-2154c(简称pC0862-2154c)和pCDNA-map2751-2762c(简称pC2751-2762c),并原核表达纯化了融合蛋白r0862-2154c和r2751-2762c。分别以融合DNA疫苗、重组亚单位疫苗、灭活苗、BCG及pCDNA3.1(+)免疫4月龄牛,共免疫3次,每次间隔2周,灭活苗和BCG仅免疫1次。于免疫后每周颈静脉采血分离血清,分别以融合蛋白r0862-2154c和r2751-2762c为包被抗原,间接ELISA方法检测血清中抗体水平;每次免疫后2周,以融合蛋白r0862-2154c和r2751-2762c混合物为刺激源,MTT法检测淋巴细胞增殖情况(刺激指数SI值);每次免疫后2周,以ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-6分泌水平;并且在三免后第三周,以牛分枝杆菌纯化蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)进行了皮内变态反应试验。结果表明,重组亚单位疫苗组的血清抗体水平明显高于其它各组,其中融合DNA疫苗组的血清抗体水平要高于灭活苗和BCG;融合DNA疫苗组的IFN-γ、SI值及IL-2分泌水平明显高于其它各组,并且分泌水平很高;融合DNA疫苗组的IL-4及IL-6分泌水平也高于其它各组,但分泌水平较低。PPD皮内变态反应试验结果显示,融合DNA疫苗组、重组亚单位疫苗组及对照组的皮肤厚度差并无变化,而灭活苗和BCG免疫组呈现阳性变态反应。本研究的实验结果表明,融合DNA疫苗对细胞免疫和体液免疫均会产生明显影响,细胞因子分泌水平明显高于其它各组,并且与PPD不发生交叉反应,表明本研究制备的融合DNA疫苗具有良好的应用前景,为副结核病新型疫苗的研究奠定了基础。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-11
前言  11-18
  1 副结核病简介  11-14
    1.1 病原体  11
    1.2 流行病学  11-13
    1.3 禽分枝杆菌副结核亚种与克隆病  13
    1.4 副结核病诊断技术的研究进展  13-14
  2 副结核病疫苗研究现状  14-16
  3 本研究的目的和意义  16-18
实验部分  18-48
  1 材料和方法  18-33
    1.1 载体、菌种和细胞  18
    1.2 血清与二抗  18
    1.3 实验动物  18
    1.4 主要试剂  18-19
    1.5 主要溶液和培养基的配制  19-24
    1.6 主要仪器  24
    1.7 引物的设计  24-25
    1.8 目的基因的扩增  25
    1.9 PCR产物与pMD18-T载体的连接转化  25-26
    1.10 重组质粒的鉴定  26-27
    1.11 真核表达载体的构建  27
    1.12 重组质粒的大量提取  27-29
    1.13 原核表达及纯化  29
    1.14 纯化蛋白的浓度测定  29-30
    1.15 动物免疫前准备  30
    1.16 动物分组及免疫接种  30
    1.17 免疫牛血清中特异性抗体的测定  30-31
    1.18 免疫牛淋巴细胞增殖试验  31
    1.19 免疫牛细胞因子的测定  31-32
    1.20 PPD皮内变态反应试验  32
    1.21 数据处理  32-33
  2 结果  33-44
    2.1 目的基因的PCR扩增  33
    2.2 重组质粒的酶切鉴定  33-34
    2.3 目的片段的序列分析  34
    2.4 原核表达纯化及浓度测定  34-35
    2.5 免疫牛血清特异性抗体的检测  35-37
    2.6 免疫牛淋巴细胞增殖水平的测定  37-38
    2.7 IFN-γ分泌水平的测定  38-40
    2.8 IL-2分泌水平的测定  40-41
    2.9 IL-4分泌水平的测定  41-42
    2.10 IL-6分泌水平的测定  42-43
    2.11 PPD皮内变态反应试验  43-44
  3 讨论  44-47
  4 结论  47-48
参考文献  48-53
致谢  53-54
作者简介  54-55
附录  55-60

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 细菌病 > 杆菌病
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