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条斑紫菜（Porphyra yezoensis）R-藻红蛋白的制备及其抗氧化、抗肿瘤活性研究

作　者: 顾丽
导　师: 胡秋辉
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 条斑紫菜 R-藻红蛋白 制备 理化特征 抗氧化 抗肿瘤
分类号: TS201.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


我国藻类资源十分丰富,是世界上最大的紫菜生产大国,集中在江苏沿海的养殖和加工,其产量占全国的95%以上。紫菜中丰富的藻红蛋白,因其抗氧化、抗癌、增强免疫力等功效,在食品、化妆品、医疗等领域得到日益广泛的应用。本文以江苏产量丰富的条斑紫菜为原料,制备了R-藻红蛋白,对其结构特性进行了研究,并通过体外活性试验评价了其生物活性,具体结果如下：条斑紫菜经超声细胞破碎、硫酸铵二次盐析、超滤膜超滤、结晶一周后,提取得到的R-藻红蛋白纯度为2.05,达到药品级要求(A562nm／A280nm>2)。用DEAE Cellulose-52 (2.6×40 cm)层析纯化R-藻红蛋白,NaCL浓度为0.2 mol/L时,洗脱出R-藻红蛋白主峰,洗脱液呈粉红色,纯度最高达5.24,符合试剂级要求(A562nm／A280nm>4)。通过紫外-可见光谱鉴定DEAE Cellulose-52柱层析得到的试剂级R-藻红蛋白的纯度,吸收波长为562 nm,540 nm处有一肩峰。SDS-PAGE电泳分离得到R-藻红蛋白的α和β亚基,α亚基的相对分子质量约为16 kDa,p亚基的相对分子质量约为19 kDa。荧光光谱分析得到,条斑紫菜纯R-藻红蛋白的激发波长为477 nm,最适发射波长为在572 nm。傅立叶转换红外光谱(FTIR)测定结果显示,药品级R-藻红蛋白,在1656 cm-1和1454 cm-1之间的双峰表明R-藻红蛋白结构中存在共轭双键。R-藻红蛋白中,含有除色氨酸外的7种必需氨基酸,占氨基酸总量的37%,含量从高到低的顺序是：亮氨酸>缬氨酸>苏氨酸>异亮氨酸>赖氨酸>苯丙氨酸>蛋氨酸。在所有的氨基酸中,呈鲜味浓的谷氨酸的含量最多,其次是丙氨酸和天门冬氨酸。R-藻红蛋白的还原力测定、羟自由基和超氧阴离子清除率的测定,证实R-藻红蛋白具有较强的还原力和抗氧化作用,对羟自由基清除率的IC50值为608.9μg／mL，在超氧阴离子清除实验中,对邻苯三酚自氧化速率的抑制率高达80.7%.R-藻红蛋白对人胃癌细胞SGC和乳腺癌细胞MCF进行的48h抑制作用研究结果表明,在实验剂量范围内,随R-藻红蛋白浓度的增加而抑瘤作用增大.对SGC的抑制,R-藻红蛋白浓度为800μg／mL时,抑制率为23.58%。当R-藻红蛋白的浓度为200μg／mL时,对MCF的抑制即达30.03%；R-藻红蛋白浓度增至1600μg／mL,其抑制率超过50%.R-藻红蛋白对两种癌细胞的抑制都呈剂量正向关系。Annexin V-FITC/PI法检测不同浓度的药品级R-藻红蛋白作用SGC 48h凋亡诱导的作用情况,对照细胞的总凋亡比例为5.04%,100、200、400、800、1600μg／mL不同浓度的R-藻红蛋白组细胞总凋亡比例分别为9.21%、5.80%、7.02%、9.71%和9.31%；R-藻红蛋白对MCF细胞的凋亡诱导实验中对照组的总凋亡比例为0.56%,而100、200、400、800μg／mL不同浓度的R-藻红蛋白组细胞总凋亡比例分别为38.68%、19.17%、20.99%和24.76%。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
第一章 文献综述  11-29
  1.1 紫菜藻红蛋白的研究进展  11-12
  1.2 藻红蛋白的提取、纯化方法  12-14
  1.3 藻红蛋白的理化特征  14-16
  1.4 藻红蛋白的生物活性及利用  16-20
    1.4.1 抗氧化  16
    1.4.2 抗肿瘤  16-18
    1.4.3 提高免疫力  18
    1.4.4 荧光探针  18
    1.4.5 肿瘤治疗  18-19
    1.4.6 天然色素  19-20
  1.5 本研究的研究意义及主要研究内容  20-22
    1.5.1 本论文的研究意义  20
    1.5.2 本论文的主要研究内容  20-22
  参考文献  22-29
第二章 条斑紫菜R-藻红蛋白的制备  29-37
  2.1 材料与方法  29-32
    2.1.1 主要原料及试剂  29-30
    2.1.2 主要仪器  30
    2.1.3 条斑紫菜原料的预处理  30
    2.1.4 条斑紫菜R-藻红蛋白浓度和纯度的测定  30-31
    2.1.5 条斑紫菜R-藻红蛋白的提取工艺流程  31-32
    2.1.6 统计方法  32
  2.2 结果与讨论  32-35
  2.3 本章小结  35-36
  参考文献  36-37
第三章 条斑紫菜R-藻红蛋白的理化特征  37-49
  3.1 材料与方法  37-39
    3.1.1 主要原料及试剂  37
    3.1.2 主要仪器  37-38
    3.1.3 紫外-可见光谱测定  38
    3.1.4 SDS-PAGE亚基分析  38
    3.1.5 荧光光谱测定  38-39
    3.1.6 傅立叶转换红外光谱(FTIR)  39
    3.1.7 氨基酸组成分析  39
  3.2 结果与讨论  39-46
    3.2.1 紫外-可见光谱  39-40
    3.2.2 SDS聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  40-42
    3.2.3 R-藻红蛋白的荧光光谱  42-43
    3.2.4 R-藻红蛋白的FTIR光谱分析  43-44
    3.2.5 氨基酸组成分析  44-46
  3.3 本章小结  46-47
  参考文献  47-49
第四章 条斑紫菜R-藻红蛋白的In vitro抗氧化、抗肿瘤活性研究  49-67
  4.1 材料与方法  49-53
    4.1.1 主要材料及试剂  49-50
    4.1.2 主要仪器  50
    4.1.3 R-藻红蛋白还原力的测定  50
    4.1.4 R-藻红蛋白清除羟基自由基能力的测定  50-51
    4.1.5 R-藻红蛋白清除超氧阴离子自由基能力的测定  51-52
    4.1.6 MTT试验  52
    4.1.7 流式细胞仪检测  52-53
  4.2 结果与讨论  53-63
    4.2.1 R-藻红蛋白的还原力  53
    4.2.2 R-藻红蛋白清除羟自由基的能力  53-55
    4.2.3 R-藻红蛋白清除超氧自由基的能力  55-56
    4.2.4 R-藻红蛋白对SGC细胞和MCF细胞的抑制作用  56-57
    4.2.5 Annexin V-FITC/PI法检测凋亡细胞  57-63
  4.3 本章小结  63-64
  参考文献  64-67
全文总结  67-69
致谢  69-71
攻读硕士学位期间发表的论文  71

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学 > 食品化学 > 蛋白质
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