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在Klebsiella oxytoca中构建不依赖辅酶B_(12)的1,3-丙二醇合成途径

作 者: 郑学瑞
导 师: 王兴华;张延平
学 校: 山西大学
专 业: 水生生物学
关键词: 二醇脱水酶 甘油脱水酶 辅酶B12 1,3-丙二醇 产酸克雷伯氏菌 丁酸梭菌
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


1,3-丙二醇(1,3-propanediol,简记1,3-PD)是一种重要的化工原料的中间产物,是工业生物技术领域研究的重要产品之一。最主要的用途是作为一种重要的单体原料,其可以合成多种重要的化工产品如:聚酯、聚醚和聚氨酯。其中,作为单体与对苯二甲酸合成新型聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT),具有许多优良特性如:生物可降解性、安全无毒等,这是许多其它合成塑料所不具有的。1,3-PD主要用于增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的合成,也用于食品、化妆品和制药等行业。目前用于生物合成1,3-PD的菌种主要有Clostridium pasteurianum、Clostridiumbutyricum、Clostridium freundii、Klebsiella pneumoniae和Klebsiella oxytoca等。本实验室前期关于K.oxytoca的研究较多,其为兼性厌氧细菌,遗传操作较为方便简单;该菌可耐受较高浓度甘油与1,3-PD,具有较高的1,3-PD生产率和得率;该菌还可直接以废弃甘油为底物进行1,3-PD生产。目前,该菌厌氧发酵甘油生产1,3-PD的途径已比较清楚,一个关键问题是:催化该途径第一步反应的二醇脱水酶需要在辅酶B12的辅助下才具有催化活性,但是很容易失活,因此成为关键性限速酶,限制了1,3-PD的生物合成。为解决这一问题,本研究拟利用基因工程手段将来源于Clostridium butyricumDSM 10702的的甘油脱水酶(一种二醇脱水酶的同工酶,但催化过程不依赖于辅酶B12)导入K.oxytoca中,以提高1,3-PD合成效率。本研究以实验室前期构建的1,3-PD高产菌K.oxytoca DA-1HB为出发菌,初步研究了上述策略的可行性。首先,对出发菌的形态、分子特性和生理生化特性进行了重新鉴定,并对该菌进行了遗传稳定性和发酵特性的研究。其次,对购自德国微生物菌种保藏中心的菌株Clostridium butyricum DSM 10702利用16S rDNA进行了鉴定,证实其为丁酸梭菌。第三,利用基因工程手段扩增了C.butyricum DSM 10702基因组中的甘油脱水酶基因及其激活因子序列,为避免有毒中间产物3-羟基丙醛积累,同时扩增了位于同一操纵子(1,3-PD操纵子)上的1,3-PD脱氢酶基因(编码1,3-PD合成途径的第二个酶)。通过连接到T vector测序,发现该操纵子与GenBank报道的C.butyricum的1,3-PD操纵子序列(序列号AY112989)具有96.07%的同源性,进一步扩增和测序研究发现该差异性源于菌种间差异。随后,利用含不同启动子的表达载体构建了表达质粒,并电转化到K.oxytoca DA-1HB中,筛选获得了携带不同表达质粒的重组产酸克雷伯氏菌。初步摇瓶发酵实验发现,携带有表达质粒pIPK的重组菌K.oxytoca PK的1,3-PD产量提高52.7%。对表达质粒在重组菌K.oxytoca PK中进行了重组质粒稳定性研究表明:重组菌PK的质粒稳定性良好,在前80代保持了100%的稳定性,从80代开始LBK+平板结果显示质粒稳定性略微下降,但是仍然保持在较高的水平。本研究通过基因工程手段在K.oxytoca中构建了不依赖辅酶B12的1,3-PD合成途径,并对质粒的稳定性及重组菌进行了初步发酵研究,对促进生物法合成1,3-PD的工业化进程具有重要意义。另外,该不依赖于辅酶B12的甘油脱水酶的1,3-PD操纵子的成功克隆,将为应用于体外酶催化转化过程提供依据。

全文目录


中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章 文献综述  10-20
  1.1 引言  10
  1.2 1,3-丙二醇的生产概况  10-11
  1.3 生物合成1,3-丙二醇的代谢途径  11-12
  1.4 二醇脱水酶研究进展  12-15
  1.5 不依赖辅酶B_(12)甘油脱水酶的研究进展  15-18
  1.6 甘油脱水酶及二醇脱水酶的克隆表达研究情况  18
  1.7 论文的研究意义和技术框架  18-20
第二章 材料与方法  20-28
  2.1 实验材料  20-22
  2.2 实验方法  22-26
  2.3 分析方法  26-27
  2.4 培养条件  27-28
第三章 产1,3-PD菌株K.oxytoca的鉴定和发酵特性研究  28-32
  3.1 产1,3-PD菌株K.oxytoca DA-1HB的鉴定  28-30
  3.2 产1,3-PD菌株K.oxytoca DA-1HB的发酵特性研究  30-32
第四章 不依赖辅酶B_(12)甘油脱水酶的克隆与表达  32-44
  4.1 C.butyricum DSM 10702分子水平鉴定  32-34
  4.2 含不依赖辅酶B_(12)甘油脱水酶的克隆  34-37
  4.3 不依赖辅酶B_(12)甘油脱水酶表达质粒的构建  37-38
  4.4 重组表达质粒在E.coli中的表达  38-39
  4.5 重组表达质粒在K.oxytoca中的表达  39-40
  4.6 重组菌与出发菌K.oxytoca DA-1HB性能比较  40-42
  4.7 重组质粒pIPK在K.oxytoca PK中稳定性研究  42-44
第五章 结论与展望  44-46
  5.1 结论  44
  5.2 展望  44-46
参考文献  46-51
附录  51-58
致谢  58-59
攻读硕士期间发表的论文  59
个人简介及联系方式  59-60

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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