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金雀异黄素对CIA大鼠关节FLS增殖、凋亡及其机制的实验研究

作　者: 张学增
导　师: 张育
学　校: 扬州大学
专　业: 内科学
关键词: 金雀异黄素 胶原诱导型关节炎 成纤维样滑膜细胞 增殖 凋亡 MAPK PI3K/AKT
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:研究金雀异黄素(genistein, Gen)对Ⅱ型胶原诱导型关节炎(collagen typeⅡinduced arthritis, CIA)大鼠关节成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制。研究对象:CIA大鼠关节成纤维样滑膜细胞方法:首先,采用Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA)共同建立CIA大鼠模型,对大鼠每周进行一次关节炎指数(arthritis index, AI)评分及后肢容积测定。于造模第六周摄取关节X线片,然后处死大鼠,取大鼠后肢关节进行关节滑膜组织病理检测,并取出关节滑膜组织,用胶原酶消化法分离培养原代FLS;采用台盼蓝拒染法检测FLS活性,噻唑蓝(MTT)法检测Gen对FLS细胞增殖的影响,免疫印迹(Western Blot)检测Gen作用CIA大鼠关节FLS细胞后其凋亡蛋白bax和bcl-2的表达情况; Western Blot检测MAPK和PI3K/AKT信号转导通路中ERK、AKT和其磷酸化形式p-ERK、p-AKT蛋白的表达量。结果:1、Ⅱ型胶原致敏后三天,大鼠开始出现关节肿胀,AI评分逐渐增高,至造模后第三周最为明显。通过观察AI评分、后肢容积测定、关节X线片以及关节滑膜组织病理发现,造模组与空白对照组比较有显著性差异。表明造模成功,可满足本实验需要。原代培养CIA大鼠滑膜细胞,培养至第4代细胞形态均一。2、经显微镜下细胞计数板计数台盼蓝染色FLS活细胞率大于90%,活性满足实验要求。MTT结果显示,造模后CIA大鼠关节FLS增殖程度明显高于正常组大鼠关节FLS,50、100和200μM的Gen均可以显著抑制CIA大鼠关节FLS增殖,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),且在不同时间段均呈剂量依赖性抑制作用。200μM的Gen作用于CIA大鼠关节FLS后,其增殖程度低于正常组FLS的增殖,其中,在72h时间段,两组比较有显著性差异(P<0.05)。Western Blotting检测凋亡蛋白水平结果显示:与正常组比较,模型组大鼠关节FLS细胞bax蛋白表达水平明显降低,而模型组大鼠关节FLS细胞bcl-2蛋白表达水平较正常组大鼠关节FLS细胞明显增高,均有显著性差异(P<0.05);与模型组比较,不同浓度的Gen作用细胞后,随着药物浓度的增加,bax蛋白表达均有不同水平的上调,其中Gen中剂量组(Gen2)和高剂量组(Gen3)与模型组比较有显著性差异(P<0.05),低剂量组(Gen1)与模型组比较无显著性差异(P>0.05);用药组bcl-2蛋白表达均有不同水平的下调,与模型组比较均有显著性差异(P<0.05)。3、Western blot检测MAPK和PI3K/AKT信号转导通路中信号蛋白表达水平结果显示:1)与正常组比较,模型组及用药组EKR、AKT表达量均无明显差异(P>0.05);模型组FLS细胞p-ERK和p-AKT表达量高于正常组,且有显著性差异(P<0.05);各Gen用药组FLS细胞p-ERK蛋白的表达均低于正常组,有显著性差异(P<0.05),且p-ERK表达的降低与Gen呈剂量依赖性。各Gen用药组FLS细胞p-AKT蛋白的表达均高于正常组,Gen1和Gen2组与正常组比较有显著性差异(P<0.05),Gen3组与正常组p-AKT表达相当(P>0.05)。2)与模型组FLS比较,各用药组ERK、AKT表达无明显差异(P>0.05);不同浓度Gen用药组FLS细胞p-ERK、p-AKT蛋白的表达均低于模型组,均有显著性差异(P<0.05),且p-ERK、p-AKT表达的降低与Gen呈剂量依赖性。结论:1、本实验CIA大鼠模型构建成功,并成功分离培养了原代大鼠关节FLS。2、Gen能够抑制CIA大鼠关节FLS细胞的增殖,同时,可调节凋亡蛋白的表达,可能通过此机制促进CIA大鼠关节FLS的凋亡,所以Gen有可能通过调节滑膜细胞增殖及凋亡间的平衡,改善关节炎大鼠滑膜过度增殖及凋亡受阻的病理改变。3、Gen能够抑制CIA大鼠关节FLS MAPK和PI3K-AKT信号转导通路活化,所以Gen可能通过调节CIA大鼠关节FLS信号通路的转导,发挥其调节细胞增殖与凋亡间平衡的作用。

全文目录


中文摘要  3-6
英文摘要  6-11
符号说明  11-13
前言  13-16
第一部分 CIA 大鼠模型建立及关节 FLS 分离培养  16-26
  1 材料和仪器  16-17
  2 实验方法  17-20
  3 数据统计  20
  4 结果  20-26
第二部分 Gen 对 CIA 大鼠关节FLS 增殖及凋亡影响的研究  26-37
  1 材料和仪器  26-27
  2 实验方法  27-33
  3 数据分析及统计方法  33
  4 结果  33-37
第三部分 Gen 对 CIA 大鼠关节FLS 中MAPK、PI3K//AKT 信号转导通路影响的研究  37-44
  1 材料和仪器  37
  2 实验方法  37-39
  3 数据分析及统计方法  39-40
  4 结果  40-44
讨论  44-50
结论  50-51
参考文献  51-57
文献综述  57-72
致谢  72-73
攻读学位期间完成的论文  73-74

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