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PVY拮抗细菌的筛选及其作用机制研究

作 者: 刘晓霞
导 师: 王凤龙
学 校: 中国农业科学院
专 业: 植物病理学
关键词: 马铃薯Y病毒 拮抗细菌 活性蛋白 作用机制
分类号: S435.72
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 46次
引 用: 1次
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内容摘要


马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是危害烟草生产的重要病毒之一,严重影响烟草的产量和品质。本研究首次从筛选抗PVY的拮抗细菌入手,进行了较深入研究,为烟草病毒病的生物防治提供了新的理论依据和技术支持。本研究首先利用DNAMAN软件对GenBank数据库中已登录的PVY全基因组序列进行序列比对,用Primer 5.0设计引物,以烟草肌动蛋白基因为内参,建立了烟草PVY Real-time PCR定量检测体系。获得的扩增曲线基线平整,指数扩增明显,斜率大;稳定性和重复性好;循环阈值和PCR起始模板量对数之间的线性关系良好。可以用于快速、灵敏、高效地定量检测PVY。利用该体系对从即墨市中国农科院烟草研究试验农场夏季烟田中分离到的103株细菌菌株进行筛选。获得了一些对PVY有拮抗作用的菌株,1号菌株和22号菌株对PVY有中度拮抗效果,他们的发酵液对PVY的抑制率平均值分别为67.68%,55.28%。其中1号菌株是由病叶表面分离得到的,22号菌株则是分离自烟草病组织内部,为内生细菌。还有许多菌株(13、14、16号菌等)对PVY有部分拮抗作用,抑制率在10%~20%之间,为土壤和内生细菌。其中从烟草根际土壤分离的菌株C10的拮抗活性最强,其发酵液对PVY的抑制率达到88.19%。并且通过16S rDNA序列分析,对菌株C10进行了分子鉴定,确定C10菌株为金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)。采用硫酸铵沉淀法沉淀C10发酵液中的蛋白质,通过DEAE-SepharoseTM Fast Flow阴离子交换层析和Sephadex-G75凝胶过滤层析,结合PVY Real-time PCR定量检测体系对洗脱液的拮抗活性的测定,从C10发酵液中分离纯化得到了三种具有拮抗PVY活性的蛋白质。SDS-PAGE凝胶电泳测定它们的分子量大小分别为40.6KDa、42.4KDa和37.8KDa,它们对PVY的抑制率分别为67.94%、55.27%、47.06%。初步推断C10拮抗细菌对PVY的拮抗作用可能主要是由其发酵液中三种低分子量的活性蛋白共同作用的结果。本研究以三生-NN烟为寄主材料,对C10菌株的拮抗机制做了进一步的探索。电镜观察发现C10发酵液中的活性蛋白对PVY有体外钝化作用。在接种前12 h,以发酵液诱导烟苗,可以大大提高烟苗对PVY侵染的抵抗能力。另外,对感染PVY 12 h的烟苗喷施C10发酵液,能将烟苗体内PVY含量控制在较低的水平。由此,初步推断该菌株的生防机制较复杂,主要表现在:一,C10发酵液中的活性蛋白可以在体外与PVY粒体直接作用,破坏外壳蛋白亚基之间的作用力,导致病毒粒体的断裂等作用,降低了病毒的侵染力;二,诱导烟草体内两种重要的防御酶POD和PPO活性提高,并且能在较长的时间内对其活性进行调控,提高了寄主植物的系统抗病性,抑制病毒在体内的复制和扩散,降低了PVY的为害。三,对感染PVY 12 h的烟株喷施C10发酵液,可以抑制PVY在体内的复制,在72 h内能将烟苗体内PVY的含量控制在较低的水平,推测可能存在较复杂的机制。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章 引言  13-19
  1.1 马铃薯Y 病毒的危害  13
  1.2 马铃薯Y 病毒病原学  13-14
  1.3 马铃薯Y 病毒的传播方式和主要防治策略  14
  1.4 植物病毒检测技术研究进展  14-17
    1.4.1 生物学鉴定  15
    1.4.2 光镜和电镜观察  15
    1.4.3 免疫学方法  15
    1.4.4 免疫电镜测定(ISEM)  15-16
    1.4.5 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测  16
    1.4.6 核酸杂交技术检测  16
    1.4.7 PCR 检测技术及其新的发展  16-17
  1.5 拮抗细菌对烟草病害防治作用的研究  17-18
  1.6 研究目的和意义  18-19
第二章 马铃薯Y 病毒拮抗细菌的筛选  19-30
  2.1 材料、试剂和仪器  19
    2.1.1 试验材料  19
    2.1.2 药品和试剂  19
    2.1.3 主要仪器  19
  2.2 试验方法和步骤  19-22
    2.2.1 细菌的分离纯化培养  19-20
    2.2.2 Real-time PCR 定量检测PVY 体系的建立  20-22
    2.2.3 利用Real-time PCR 定量检测PVY 体系筛选PVY 拮抗细菌  22
  2.3 结果与分析  22-27
    2.3.1 细菌分离和纯化  22-23
    2.3.2 RNA 检测  23
    2.3.3 PVY 基因和actin 基因的标准曲线  23
    2.3.4 Real-time PCR 定量检测体系的准确性分析  23-27
    2.3.5 Real-time PCR 定量检测体系的重现性分析  27
    2.3.6 PVY 拮抗细菌  27
  2.4 讨论  27-29
    2.4.1 PVY 的主要检测手段  27-28
    2.4.2 荧光定量PCR 体系的优化  28-29
  2.5 小结  29-30
第三章 拮抗细菌C10 的分子鉴定  30-38
  3.1 材料、试剂和仪器  30
    3.1.1 材料  30
    3.1.2 试剂  30
    3.1.3 主要仪器  30
  3.2 试验方法和步骤  30-34
    3.2.1 拮抗细菌C10 基因组DNA 的提取  30-31
    3.2.2 16s rDNA 扩增  31-32
    3.2.3 目的片段回收  32
    3.2.4 连接  32-33
    3.2.5 连接产物对感受态细胞的转化  33
    3.2.6 质粒提取  33
    3.2.7 重组克隆的双酶切鉴定  33-34
    3.2.8 16s rDNA 序列测定与分析  34
  3.3 结果与分析  34-36
    3.3.1 细菌C10 基因组DNA 提取结果  34-35
    3.3.2 16s rDNA 扩增产物检测  35
    3.3.3 双酶切鉴定重组克隆结果  35
    3.3.4 16s rDNA 序列测定结果  35-36
  3.4 讨论  36-37
  3.5 小结  37-38
第四章 拮抗细菌C10 活性蛋白的分离纯化  38-45
  4.1 材料、试剂和仪器  38
    4.1.1 供试材料  38
    4.1.2 药品和试剂  38
    4.1.3 仪器  38
  4.2 试验方法  38-41
    4.2.1 蛋白浓度测定  38
    4.2.2 C10 发酵液的制备  38
    4.2.3 上样蛋白的制备  38-39
    4.2.4 DEAE-SepharoseTM Fast Flow 阴离子交换层析  39
    4.2.5 离子交换层析后洗脱液中蛋白拮抗活性的测定  39
    4.2.6 Sephadex-G75 凝胶过滤层析  39
    4.2.7 凝胶过滤层析后洗脱液中蛋白拮抗活性的测定  39
    4.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  39-40
    4.2.9 银染  40-41
  4.3 结果与分析  41-43
  4.4 讨论  43-44
    4.4.1 蛋白质的沉淀方法比较  43
    4.4.2 离子交换层析和凝胶层析的选择  43-44
  4.5 小结  44-45
第五章 作用机制初探  45-55
  5.1 材料、试剂和仪器  45
    5.1.1 试验材料  45
    5.1.2 试剂  45
    5.1.3 仪器  45
  5.2 试验方法和步骤  45-47
    5.2.1 透射电镜下观察C10 发酵液中活性蛋白对PVY 粒体形态的影响  45-46
    5.2.2 拮抗细菌C10 发酵液诱导三生-NN 烟系统抗性的研究  46-47
    5.2.3 C10 发酵液对感染PVY 的三生-NN 烟的作用研究  47
  5.3 结果与分析  47-52
    5.3.1 活性蛋白对PVY 粒体形态的影响  47
    5.3.2 C10 发酵液诱导三生-NN 烟产生系统抗性  47-50
    5.3.3 C10 发酵液对烟草叶片内POD 和PPO 活性的影响  50-51
    5.3.4 C10 发酵液对感染PVY 的三生-NN 烟体内病毒复制具有抑制作用  51-52
  5.4 讨论  52-54
    5.4.1 天然产物对植物病毒粒体的体外抑制作用  52-53
    5.4.2 POD 和PPO 活性与烟草对病毒抗性的关系  53-54
    5.4.3 C10 对马铃薯Y 病毒病的拮抗作用机制较复杂  54
  5.5 小结  54-55
第六章 结论与讨论  55-57
  6.1 讨论  55
    6.1.1 C10 的开发应用前景  55
    6.1.2 PVY 生物防治展望  55
  6.2 主要结论  55-56
  6.3 创新点  56-57
参考文献  57-63
致谢  63-64
作者简历  64

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