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水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ospgip1)克隆与表达
作 者: 刘晓维
导 师: 徐敬友
学 校: 扬州大学
专 业: 植物病理学
关键词: 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 Ospgip1克隆 生物信息学分析 原核表达 时空表达 诱导表达 RT-PCR Real Time PCR 水稻
分类号: S511
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种能够特异性识别和结合真菌内切多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性的蛋白,其富含亮氨酸重复(LRR),在植物抗真菌过程中发挥重要作用。本研究以水稻品种Lemont、Jasmine85和YSBR1为材料,克隆水稻PGIP基因(Ospgip1),并进行原核表达,同时明确OsPGIP1对水稻纹枯病菌PG的抑制活性。另外,通过荧光定量PCR,分析Ospgip1在水稻不同抗、感纹枯病品种中的时空表达,以及黄化处理和病菌侵染对Ospgip1的诱导表达,从而探明PGIP表达量与品种抗病性的关系。具体结果如下:1、通过PCR技术,克隆获得Ospgip1基因。该基因全长为1 184 bp,具有930 bp的完整开放阅读框(ORF),终止密码子为TAA,无内含子。生物信息学分析表明,OsPGIP1由309个氨基酸组成,含9个LRR重复,1个疏水性N端信号肽;二级结构LRR区含有α-螺旋和β-折叠各9个,分别位于LRR首尾,此外,不规则盘绕(卷曲)占有较高比例(53%);三级结构倾向于产生纤维状构象。2、RT-PCR研究表明,Ospgip1在水稻抗、感纹枯病品种中均能表达,但在不同生育期、不同部位是否表达则有差异。根据Real Time PCR测定,水稻抗病品种YSBR1和Jasmine85中Ospgip1的表达量要明显高于感病品种Lemont,表明Ospgip1表达与品种抗病性有一定关系。3、Real Time PCR研究显示,稻苗黄化处理后,无论是抗病品种还是感病品种的Ospgip1表达均显著提高。但是,纹枯病菌侵染使得抗病品种Ospgip1表达量大大增加,而对感病品种影响不大。
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全文目录
中文摘要 7-8 英文摘要 8-10 前言 10-24 一、植物抗病分子机制 10-13 (一) 植物抗病类型 10-11 (二) 植物抗病基因及识别 11-12 (三) 植物防卫基因及防卫反应 12-13 (四) 植物抗病信号传导 13 二、植物抗病基因工程 13-18 (一) 外源基因转化 14-15 1、几丁质酶 14 2、β-1, 3-葡聚糖酶 14-15 3、溶菌酶 15 4、细菌素 15 5、核糖体失活蛋白 15 6、防御素 15 (二) 内源基因修饰和诱导 15-17 1、提高自身免疫性 16 2、增强激发子作用 16 3、促进活性氧产生 16 4、细胞程序死亡 16-17 (三) 转基因方法 17-18 1、农杆菌介导法 17 2、基因枪法 17 3、离子束介导法 17 4、脂质体法(阳离子转化法) 17-18 5、花粉管通道法 18 三、植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)及其基因 18-23 (一) PGIP 结构及理化特性 18-20 (二) PGIP 抗病功能及机制 20-21 (三) PGIP 含量与分布 21 (四) PGIP 基因及其表达 21-22 (五) PGIP 在植物抗真菌基因工程中的应用 22-23 (六) 水稻PGIP 及其基因 23 四、本研究目的和意义 23-24 材料与方法 24-33 一、供试植株 24 二、供试菌株 24 (一) 水稻纹枯病菌 24 (二) 大肠杆菌 24 三、质粒载体 24 四、试剂和仪器 24-25 (一) 主要试剂 24-25 (二) 主要仪器 25 五、水稻基因组 DNA 提取 25-26 (一) DNA 提取方法 25-26 (二) DNA 纯度和浓度测定 26 六、水稻 Ospgip1 基因克隆与序列分析 26-30 (一) 引物设计 26 (二) PCR 扩增 26-27 (三) PCR 产物纯化 27 (四) 重组质粒构建 27 (五) 感受态细胞制备与转化 27-28 (六) 重组子酶切验证 28-29 1、微量质粒 DNA 提取 28 2、酶切验证 28-29 (七) 测序 29 (八) 生物信息学分析 29-30 1、序列相似性比对 29 2. ORF 查找 29 3、蛋白质结构预测 29-30 4、蛋白质性质与功能分析 30 5、系统进化树构建 30 七、水稻Ospgip1 基因的时空表达 30-31 (一) 总RNA 提取 30-31 (二) 反转录PCR(RT-PCR) 31 (三) 荧光定量PCR(Real Time PCR) 31 八、水稻 Ospgip1 基因的诱导表达 31-33 (一) 黄化处理 31-32 (二) 病菌接种 32-33 结果与分析 33-47 一、水稻Ospgip1 基因的克隆与序列分析 33-44 (一) 基因组 DNA 提取 33-34 (二) Ospgip1 基因克隆 34-35 (三) Ospgip1 序列分析 35-44 1.O RF 与序列相似性 35 2、蛋白质一级结构 35-37 3、蛋白质二级结构 37-38 4、蛋白质三级结构 38-39 5、蛋白质性质与功能 39-43 6、系统进化 43-44 二、水稻 Ospgip1 基因的时空表达 44-46 (一) 不同品种、不同生育期、不同部位 Ospgip1 的表达 44-45 (二) 不同品种、不同生育期茎部Ospgip1 表达量的差异 45-46 三、水稻 Ospgip1 基因的诱导表达 46-47 (一) 黄化处理对Ospgip1 表达的诱导 46 (二) 纹枯病菌侵染对 Ospgip1 表达的诱导 46-47 讨论 47-52 一、水稻 Ospgip1 基因及其产物的特征 47-48 (一) 序列与结构 47-48 (二) 系统进化 48 二、水稻 Ospgip1 基因的表达 48-50 (一) 时空表达 48-49 (二) 诱导表达 49-50 三、水稻 Ospgip1 基因的功能 50-51 四、Ospgip1 基因在水稻抗病育种中的利用 51-52 参考文献 52-63 附录 63-65 致谢 65
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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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