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水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ospgip1)克隆与表达

作 者: 刘晓维
导 师: 徐敬友
学 校: 扬州大学
专 业: 植物病理学
关键词: 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 Ospgip1克隆 生物信息学分析 原核表达 时空表达 诱导表达 RT-PCR Real Time PCR 水稻
分类号: S511
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 43次
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内容摘要


植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种能够特异性识别和结合真菌内切多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性的蛋白,其富含亮氨酸重复(LRR),在植物抗真菌过程中发挥重要作用。本研究以水稻品种Lemont、Jasmine85和YSBR1为材料,克隆水稻PGIP基因(Ospgip1),并进行原核表达,同时明确OsPGIP1对水稻纹枯病菌PG的抑制活性。另外,通过荧光定量PCR,分析Ospgip1在水稻不同抗、感纹枯病品种中的时空表达,以及黄化处理和病菌侵染对Ospgip1的诱导表达,从而探明PGIP表达量与品种抗病性的关系。具体结果如下:1、通过PCR技术,克隆获得Ospgip1基因。该基因全长为1 184 bp,具有930 bp的完整开放阅读框(ORF),终止密码子为TAA,无内含子。生物信息学分析表明,OsPGIP1由309个氨基酸组成,含9个LRR重复,1个疏水性N端信号肽;二级结构LRR区含有α-螺旋和β-折叠各9个,分别位于LRR首尾,此外,不规则盘绕(卷曲)占有较高比例(53%);三级结构倾向于产生纤维状构象。2、RT-PCR研究表明,Ospgip1在水稻抗、感纹枯病品种中均能表达,但在不同生育期、不同部位是否表达则有差异。根据Real Time PCR测定,水稻抗病品种YSBR1和Jasmine85中Ospgip1的表达量要明显高于感病品种Lemont,表明Ospgip1表达与品种抗病性有一定关系。3、Real Time PCR研究显示,稻苗黄化处理后,无论是抗病品种还是感病品种的Ospgip1表达均显著提高。但是,纹枯病菌侵染使得抗病品种Ospgip1表达量大大增加,而对感病品种影响不大。

全文目录


中文摘要  7-8
英文摘要  8-10
前言  10-24
  一、植物抗病分子机制  10-13
    (一) 植物抗病类型  10-11
    (二) 植物抗病基因及识别  11-12
    (三) 植物防卫基因及防卫反应  12-13
    (四) 植物抗病信号传导  13
  二、植物抗病基因工程  13-18
    (一) 外源基因转化  14-15
      1、几丁质酶  14
      2、β-1, 3-葡聚糖酶  14-15
      3、溶菌酶  15
      4、细菌素  15
      5、核糖体失活蛋白  15
      6、防御素  15
    (二) 内源基因修饰和诱导  15-17
      1、提高自身免疫性  16
      2、增强激发子作用  16
      3、促进活性氧产生  16
      4、细胞程序死亡  16-17
    (三) 转基因方法  17-18
      1、农杆菌介导法  17
      2、基因枪法  17
      3、离子束介导法  17
      4、脂质体法(阳离子转化法)  17-18
      5、花粉管通道法  18
  三、植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)及其基因  18-23
    (一) PGIP 结构及理化特性  18-20
    (二) PGIP 抗病功能及机制  20-21
    (三) PGIP 含量与分布  21
    (四) PGIP 基因及其表达  21-22
    (五) PGIP 在植物抗真菌基因工程中的应用  22-23
    (六) 水稻PGIP 及其基因  23
  四、本研究目的和意义  23-24
材料与方法  24-33
  一、供试植株  24
  二、供试菌株  24
    (一) 水稻纹枯病菌  24
    (二) 大肠杆菌  24
  三、质粒载体  24
  四、试剂和仪器  24-25
    (一) 主要试剂  24-25
    (二) 主要仪器  25
  五、水稻基因组 DNA 提取  25-26
    (一) DNA 提取方法  25-26
    (二) DNA 纯度和浓度测定  26
  六、水稻 Ospgip1 基因克隆与序列分析  26-30
    (一) 引物设计  26
    (二) PCR 扩增  26-27
    (三) PCR 产物纯化  27
    (四) 重组质粒构建  27
    (五) 感受态细胞制备与转化  27-28
    (六) 重组子酶切验证  28-29
      1、微量质粒 DNA 提取  28
      2、酶切验证  28-29
    (七) 测序  29
    (八) 生物信息学分析  29-30
      1、序列相似性比对  29
      2. ORF 查找  29
      3、蛋白质结构预测  29-30
      4、蛋白质性质与功能分析  30
      5、系统进化树构建  30
  七、水稻Ospgip1 基因的时空表达  30-31
    (一) 总RNA 提取  30-31
    (二) 反转录PCR(RT-PCR)  31
    (三) 荧光定量PCR(Real Time PCR)  31
  八、水稻 Ospgip1 基因的诱导表达  31-33
    (一) 黄化处理  31-32
    (二) 病菌接种  32-33
结果与分析  33-47
  一、水稻Ospgip1 基因的克隆与序列分析  33-44
    (一) 基因组 DNA 提取  33-34
    (二) Ospgip1 基因克隆  34-35
    (三) Ospgip1 序列分析  35-44
      1.O RF 与序列相似性  35
      2、蛋白质一级结构  35-37
      3、蛋白质二级结构  37-38
      4、蛋白质三级结构  38-39
      5、蛋白质性质与功能  39-43
      6、系统进化  43-44
  二、水稻 Ospgip1 基因的时空表达  44-46
    (一) 不同品种、不同生育期、不同部位 Ospgip1 的表达  44-45
    (二) 不同品种、不同生育期茎部Ospgip1 表达量的差异  45-46
  三、水稻 Ospgip1 基因的诱导表达  46-47
    (一) 黄化处理对Ospgip1 表达的诱导  46
    (二) 纹枯病菌侵染对 Ospgip1 表达的诱导  46-47
讨论  47-52
  一、水稻 Ospgip1 基因及其产物的特征  47-48
    (一) 序列与结构  47-48
    (二) 系统进化  48
  二、水稻 Ospgip1 基因的表达  48-50
    (一) 时空表达  48-49
    (二) 诱导表达  49-50
  三、水稻 Ospgip1 基因的功能  50-51
  四、Ospgip1 基因在水稻抗病育种中的利用  51-52
参考文献  52-63
附录  63-65
致谢  65

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 >
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