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日本血吸虫新基因SjNANOS和SjMSP的克隆、表达及其生物学功能初步分析

作　者: 王艳
导　师: 林矫矫
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本血吸虫 NANOS MSP 克隆表达免疫保护 RNAi
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

血吸虫病（schistosomiasis）是一种危害严重、分布广泛的人畜共患病。半个多世纪以来,我国血吸虫病防治取得了举世瞩目的成就,但由于重复感染严重,单靠治疗药物不能控制血吸虫病的流行,加强血吸虫病疫苗候选分子的筛选和疫苗的研制开发无疑是血吸虫病防治的重要举措。血吸虫是吸虫中少见的雌雄异体虫体,雌雄合抱是雌虫发育成熟的前提。分离、鉴定与血吸虫性别分化、发育相关的分子,对探讨血吸虫的性别发育及成熟机制,筛选新的抗血吸虫疫苗候选分子都具有重要意义。作者从本实验室构建的7天童虫消减cDNA文库中,挑选两个童虫高表达EST序列,开展以下研究:1、新基因SjNANOS和SjMSP的克隆及在不同发育阶段虫体的表达分析。由获得的EST序列作为询问序列设计特异引物进行PCR扩增,克隆这两个基因的全长cDNA。通过BLAST比对,这两个基因核苷酸序列与日本血吸虫其他已知基因无显著同源性,为日本血吸虫的新基因。氨基酸序列比较发现其中一基因编码蛋白与曼氏血吸虫NANOS蛋白（登录号ref|XP₀02576493）有67%同源性,命名为SjNANOS,另一蛋白与曼氏血吸虫MSP蛋白（登录号ref|XP₀02574028.1）有79%的同源性,命名为SjMSP。SjNANOS（GenBank登录号为AY814948）序列长721bp,其中ORF大小为525bp,编码175个氨基酸,理论分子量为19.9道尔顿。SjMSP序列（GenBank的登录号为AY814293）全长为1716bp,其中ORF为1065bp,编码354个氨基酸,理论分子量为39553.92道尔顿。以看家基因NADH为内参,应用荧光定量PCR技术分析了SjNANOS和SjMSP基因在日本血吸虫7d、13d、18d、23d、32d和42d雌雄虫体内的表达情况,结果显示,SjNANOS和SjMSP在日本血吸虫童虫和成虫均有表达,其中都在18d童虫表达量最高,同时SjNANOS在雌虫的表达量高于雄虫,SjMSP在雄虫的表达量高于雌虫,提示这两个基因可能在血吸虫性别分化、发育中发挥了作用。2、SjNANOS和SJMSP的表达及动物保护试验。成功构建了pET28a（+）-SjNANOS和pET28a（+）-SjMSP重组原核表达质粒,两种重组蛋白都在E.coli（DE3）中以包涵体形式表达,分子量分别为21kD和42kD,Western blotting分析表明融合蛋白具有较好的抗原性。用纯化的SjNANOS/HIS和SjMSP/HIS重组蛋白免疫BALB/c小鼠,结果与空白对照组相比,重组蛋白SjNANOS/HIS在小鼠中分别诱导了31.4%的减虫率和53.8%的肝脏减卵率,差异极显著（p<0.01）。重组蛋白SjMSP/HIS诱导了24.8%的减虫率和20%的肝脏减卵率,差异显著（p<0.05）。应用ELISA方法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平变化,结果SjNANOS和SjMSP重组蛋白免疫组小鼠在3次免疫后均诱导产生了高水平的特异性IgG抗体,推测重组蛋白SjNANOS和SjMSP在小鼠中诱导产生的免疫保护作用可能与免疫小鼠血清中高滴度的特异性IgG抗体有关。3、RNA干扰NANOS基因表达的研究。利用RNAi技术对SjNANOS基因表达进行了初步探索,根据日本血吸虫NANOS基因序列设计3对特异性dsRNA分子S144、S323和S396,并分别以不同的剂量（2.0μg和20μg）加入到培养体系中干扰靶基因的表达。利用Real-time PCR、Western bloting等技术检测SjNANOS基因的转录,其中以S323的干扰效果最好,在培养6天时抑制率可高达88%。比较了不同的转染方式对靶基因表达的干扰效果,结果证明电击法的效果略优于浸泡法。分析了S323 dsRNA分子干扰NANOS基因的剂量效应,结果表明,dsRNA分子干扰目标基因的表达具有剂量依赖性,培养3天时,加入最高剂量（40μg）dsRAN分子可使转录水平降低84%。采用尾静脉注射技术将dsRNA分子导入到血吸虫感染的BALB/c小鼠体内,结果表明在动物体内SjNANOS基因的转录和表达也受到明显抑制。体内外干扰试验还表明,当SjNANOS的转录和表达受到抑制时,血吸虫的发育与合抱均受到影响,暗示该基因在血吸虫的生长发育中可能具有重要作用。本文首次克隆和表达了两个日本血吸虫新基因SjNANOS和SjMSP。小鼠免疫试验表明这两种基因重组抗原都可诱导部分免疫保护作用。体内外RNAi试验表明当SjNANOS基因的表达受抑制时,血吸虫的发育与合抱均受到影响。本文研究结果为深入探讨SjNANOS和SjMSP的生物学功能,筛选新的血吸虫病疫苗候选分子和药物靶标提供了基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-15
第一章绪论  15-28
  1.1 前言  15-17
  1.2 血吸虫疫苗的研究  17-20
    1.2.1 血吸虫病疫苗研制的必要性和可行性  17
    1.2.2 血吸虫病疫苗研制历史及现状  17-20
    1.2.3 展望  20
  1.3 血吸虫性别差异表达基因的研究进展  20-24
    1.3.1 血吸虫性别特异性基因的研究进展  21-24
    1.3.2 对血吸虫性别特异性基因研究的展望  24
  1.4 RNAi 技术及其在血吸虫研究中的应用  24-28
    1.4.1 RNAi 现象的发现  24-25
    1.4.2 RNAi 现象的作用机制  25-26
    1.4.3 RNAi 的应用与前景  26-27
    1.4.4 RNAi 在血吸虫学研究上的应用  27
    1.4.5 结语  27-28
第二章日本血吸虫新基因SjNANOS和SjMSP的克隆及在童虫和成虫中mRNA的表达  28-41
  2.1 材料和方法  28-33
    2.1.1 材料  28-29
    2.1.2 方法  29-33
  2.2 结果  33-39
    2.2.1 SjNANOS、SjMSP 基因的克隆  33-34
    2.2.2 SjNANOS、SjMSP 基因的生物信息学分析  34-38
    2.2.3 SjNANOS、SjMSP 基因的期别、性别差异表达分析  38-39
  2.3 讨论  39-41
第三章 SjNANOS、SjMSP 基因的表达和重组蛋白的免疫保护效果评估  41-55
  3.1 材料与方法  41-49
    3.1.1 材料  41-42
    3.1.2 方法  42-49
  3.2 结果  49-53
    3.2.1 重组原核表达质粒pET28a(+)-SjNANOS、pET28a(+)-SjNANOS 的构建  49
    3.2.2 SjNANOS 在大肠杆菌中的表达和重组蛋白的纯化  49-51
    3.2.3 表达产物的抗原性分析  51-52
    3.2.4 SjNANOS、SjMSP 重组蛋白的动物保护实验  52
    3.2.5 特异性IgG 抗体检测  52-53
  3.3 讨论  53-55
第四章RNA 干扰日本血吸虫NANOS 基因的功能研究  55-67
  4.1 材料与方法  55-58
    4.1.1 材料  55-56
    4.1.2 方法  56-58
  4.2 结果  58-65
    4.2.1 RNA 干扰对雌雄虫发育及合抱的影响  58-59
    4.2.2 RT-PCR 和免疫印迹分析  59-61
    4.2.3 不同剂量dsRNA 分子抑制效果的比较  61-62
    4.2.4 电穿孔法与浸泡法干扰效果的比较  62
    4.2.5 荧光标记的siRNA 分子在虫体内的分布  62-63
    4.2.6 SiRNA 分子体内干扰SjNANOS 基因  63-65
  4.3 讨论  65-67
第五章全文结论  67-68
参考文献  68-74
附录  74-77
致谢  77-78
作者简历  78

日本血吸虫新基因SjNANOS和SjMSP的克隆、表达及其生物学功能初步分析

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