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日本血吸虫Frizzled家族受体的克隆、表达及其生物学功能分析

作　者: 王孝波
导　师: 冯新港
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本血吸虫 Wnt信号通路 Frizzled 9受体克隆表达期别转录本组织定位
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

血吸虫生长、发育、性成熟及产卵等生物学过程主要是由细胞间各种信号网络调控的。以前,本课题组首次克隆了与日本血吸虫Wnt信号途径相关的可能的配体SjWnt4和SjWnt10a、可能的受体SjFz5和SjFz7等基因、以及其它一些组分分子;同时结合生物信息学分析,初步明确了日本血吸虫体内也存在Wnt信号途径。但是,对血吸虫Wnt信号途径在虫体生长发育上的功能及其确定的分子机制尚有待阐明。其中,Wnt信号分子(配体)与Frizzled(Fz)受体的相互作用是Wnt途径的启始步骤,阐明它们的相互作用机制,对了解血吸虫WNT途径的发育生物学功能具有重要意义。又由于一种Wnt可能和Fz受体家族不同成员作用,不同的Wnt也可能作用于同一种Fz受体,即Wnt分子与Fz受体的结合主要取决于Fz受体及其所在组织环境,故有必要对日本血吸虫Fz家族成员的种类、表达特征、组织分布、以及具体的受体-配体组合情况等进行研究,为进一步阐明血吸虫Wnt信号途径的生物学功能提供基础。因此,本研究在获得了2个日本血吸虫Fz受体分子SjFz5和SjFz7的基础上,又进一步获得了2个Fz受体分子SjFz1和SjFz9的信息;并对克隆的3个SjFzs(SjFz5、SjFz7、SjFz9)基因在日本血吸虫发育的不同时期的mRNA表达图式进行了分析;对SjFz9分子进行了组织定位研究;在293T细胞中成功表达了SjFz5。旨在为查明日本血吸虫SjFz家族的种类以及它们在血吸虫Wnt信号途径中的功能提供基础。利用简并PCR方法从日本血吸虫13d童虫cDNA中获得两个EST,分别与其它物种Frizzled 1和Frizzled 9基因同源。根据EST序列,利用RACE技术、并用电子拼接等方法成功克隆得日本血吸虫Frizzled 9编码基因SjFz9。生物信息学软件分析显示,该基因的完整cDNA为3670 bp,编码923个氨基酸,预测相对分子量为103.97 kD,与曼氏血吸虫Frizzled类受体相似性为79%,与爪蟾Frizzled 9的相似性为33%;对蛋白序列的预测结果表明,SjFz9蛋白具有十分典型的Frizzled家族蛋白特征:N-端的半胱氨酸富集区(cysteine rich domain, CRD)和七个跨膜的α螺旋疏水区。用实时定量PCR分析了日本血吸虫SjFzs(SjFz5、SjFz7、SjFz9)基因在不同期别的mRNA表达图式,发现SjFz5 mRNA在7d童虫表达量最高,13d和18d次之,在虫卵也有中等程度表达,而在成虫阶段表达量极低;SjFz7基因7d和13d童虫也呈现较高转录水平,在成虫阶段均有中等或微量转录,除了在23d、29d和42d雌虫中的转录水平有明显升高; SjFz9基因转录水平在13d童虫较高,在18d与23d虫体期较低,而在29d和42d的雌虫以及26d和42d的雄虫又呈现较高的转录水平。提示日本血吸虫SjFzs分子的功能可能与血吸虫早期发育和生殖产卵等密切相关。分别构建了SjFzs基因的原核表达质粒,应用Western blot方法鉴定了重组质粒在大肠杆菌系统的成功表达。以表达的重组蛋白为抗原分别成功制备了SjFz5、SjFz7、SjFz9的小鼠多抗血清,并利用ELISA方法检测了效价,Western blot方法鉴定了血清的特异性。并应用免疫组化(IHC)方法,以SjFz9的多抗检测了该蛋白在不同期别虫体的组织定位,结果显示其主要分布在血吸虫童虫和成虫的吸盘及体壁肌层细胞膜上,且于雌雄虫的生殖器也有明显定位。提示SjFz9蛋白的功能可能与血吸虫的运动以及生殖器官发育等过程相关。还应用分子克隆技术构建了SjFz5CRD和SjWnt4除信号肽部分的真核表达重组质粒pRK5-SjFz5CRD和pMK33-SjWnt4,且通过免疫荧光方法鉴定了重组质粒pRK5-SjFz5CRD在293T细胞中成功表达。为在细胞模型上研究SjFzsCRD和SjWnt4的作用提供了基础。总之,本研究成功获得了日本血吸虫Fz家族新基因SjFz9全序列(GenBank登录号:GQ500895);初步推测血吸虫Fz家族受体可能参与调节日本血吸虫早期阶段的发育和生殖生理等生物学过程;Fz受体分子的CRD部分可以在293T细胞中成功表达。本论文的研究为进一步研究SjFzs基因的功能和鉴定血吸虫Wnt信号途径的受体-配体作用模式奠定了基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章绪论  14-22
  1.1 前言  14-15
  1.2 Wnt 信号通路对生物体生长发育的影响  15-18
    1.2.1 Wnt 信号分子  15-16
    1.2.2 Wnt 信号通路的级联反应  16
    1.2.3 Wnt 信号通路的分类及参与的主要受体分子  16-17
    1.2.4 Wnt 信号通路对生物体生长发育的影响  17-18
    1.2.5 血吸虫 Wnt 信号通路的研究展望  18
  1.3 Frizzled 蛋白受体生物学特征及其对生物体发育的影响  18-22
    1.3.1 frizzled 基因的发现及其进化  18-19
    1.3.2 Frizzled 家族蛋白结构  19-20
    1.3.3 Frizzled 与G 蛋白偶联作用关系  20
    1.3.4 Frizzled 受体生物学功能研究  20-21
    1.3.5 结语  21-22
第二章日本血吸虫 Frizzled 受体新基因的克隆  22-35
  2.1 材料和方法  22-28
    2.1.1 材料  22-23
    2.1.2 方法  23-28
  2.2 结果  28-34
    2.2.1 日本血吸虫 Fz 家族新基因的获得  28-29
    2.2.2 SjFz9 核苷酸及氨基酸序列的生物信息学分析  29-34
  2.3 讨论  34-35
第三章日本血吸虫Frizzled 家族受体在不同期别虫体的mRNA 表达图式及组织定位分析  35-51
  3.1 材料方法  35-43
    3.1.1 材料  35-36
    3.1.2 方法  36-43
  3.2 结果  43-49
    3.2.1 SjFzs 分子在不同发育阶段血吸虫的mRNA 表达图式  43-45
    3.2.2 pET28a-SjFzs-CRD 重组质粒的构建  45-46
    3.2.3 His 标签重组蛋白的表达、纯化与鉴定  46-47
    3.2.4 对血吸虫SjFzs 多抗的特异性分析  47-48
    3.2.5 血吸虫 SjFz9 蛋白在虫体不同发育阶段的组织定位  48-49
  3.3 讨论  49-51
第四章日本血吸虫 SjWnt4 和 SjFz5 分子在真核细胞的表达鉴定  51-59
  4.1 材料和方法  51-55
    4.1.1 材料  51-52
    4.1.2 方法  52-55
  4.2 结果  55-57
    4.2.1 真核质粒的构建  55-56
    4.2.2 293T 细胞的培养  56-57
    4.2.3 重组质粒的转染及表达鉴定  57
  4.3 讨论  57-59
第五章全文结论  59-61
参考文献  61-67
附录  67-70
致谢  70-71
作者简历  71

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜寄生虫学
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