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饲料中半乳寡糖和棉子糖对花鲈生长、免疫以及肠道菌群的影响
作 者: 葛红云
导 师: 薛敏
学 校: 中国农业科学院
专 业: 动物营养与饲料科学
关键词: 花鲈 半乳寡糖 棉子糖 非特异性免疫 抗应激 嗜水气单胞菌 肠道细菌 多样性 稀释涂布平板 PCR-DGGE 16S rRNA
分类号: S963
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
本试验研究两种低聚寡糖半乳寡糖和棉子糖对肉食性鱼类花鲈(Lateolabrax japonicus)生长性能、血液生理生化指标、非特异性免疫、抗氧化功能、抗嗜水气单胞菌累积存活率及肠道微生物结构的影响。确定半乳寡糖和棉子糖在花鲈饲料中的最适添加量,并对二者作为益生素添加剂的功能进行比较研究。本研究共包括5个部分试验,摘要如下:1、试验一评价乳源益生素半乳寡糖对花鲈生长、免疫及抗嗜水气单胞菌的效果。试验共有五个处理组: 0(对照组), 20, 40, 80和200g/kg半乳寡糖;每种饲料通过挤压旋转成球机器制成颗粒。每个处理3个重复,花鲈的初始体重3g左右,试验在260L的纤维玻璃缸循环养殖系统中进行。试验共持续16周,16周饲喂试验结束后,进行空气暴露试验和嗜水气单胞菌攻毒试验。结果表明,饲料中添加20g/kg以上半乳寡糖显著提高花鲈的抗病能力(P < 0.05),嗜水气单胞菌攻毒后,试验组鱼的成活率显著高于对照组(P < 0.05)。40g/kg和80g/kg半乳寡糖组增加了花鲈的生长性能,但与对照组没有显著差异( P > 0.05 )。最高剂量组200g/kg花鲈血清中的丙二醛(MDA)显著较其它组高(P < 0.05),表示鱼体过氧化程度较高,这可能与较高的饲料蛋白含量有关。建议在花鲈饲料中添加40~80g/kg半乳寡糖。2、试验二研究了棉子糖对花鲈生长、非特异性免疫、抗应激能力和嗜水气单胞菌攻毒后累积存活率的影响。基础饲料依据花鲈营养需求配制。试验设计5个处理,棉子糖在饲料中的添加量分别为:0(对照组)、200、400、800和2000 mg/Kg,分别命名为R0、R200、R400、R800和R2000。每个处理3个重复,每个重复30尾鱼(初始体重3g左右)。试验共持续16周,试验结束后称重并取血清样品用于测定免疫和抗氧化指标。此外还分别进行了30s空气暴露应激和嗜水气单胞菌攻毒试验。结果表明,各试验组花鲈存活率和摄食率没有显著差异(P > 0.05 );R800组增重率显著高于对照组、R400和R2000组(P < 0.05)。R400组饲料系数显著高于R800组(P < 0.05),而R400组的蛋白质效率显著低于R800组(P < 0.05),但与其它各组没有显著差异。各组间蛋白质沉积率没有显著差异(P > 0.05 );各个处理间肝指数没有显著差异( P > 0.05 );对照组、R200和R2000肥满度显著高于R400和R800组(P < 0.05);R800组花鲈内脏比显著低于R400组。各组间血清溶菌酶、超氧化物歧化酶活力和氧化产物丙二醛含量没有差异。30s空气暴露应激后血清葡萄糖和皮质醇也没有显示差异,但嗜水汽单胞菌(Aeromonas hydrophila Hoshina)攻毒后对照组累计存活率为65%,显著低于各试验组。棉子糖在花鲈饲料里适宜添加量为800mg/kg。3、试验三通过稀释涂布平板法,对花鲈肠道细菌进行计数和分离培养,分析半乳寡糖和棉子糖作为饲料添加剂对花鲈肠道微生物数量以及多样性的影响。结果表明,饲喂添加半乳寡糖和棉子糖的花鲈肠道细菌起始数量3.38×104cfu/g,8周后细菌数量级为108 cfu/g;16周后肠道细菌数量级为1011 cfu/g。16周时,对照组分离到了11株细菌,10株为假单胞菌,1株为气单胞菌。在16周半乳寡糖试验组中,G4处理组分离到了7株细菌,4株为芽孢杆菌;G20处理组分离到6株细菌,2株为气单胞菌。在16周棉子糖试验组中,R200处理分离到11株细菌,1株为芽孢杆菌;R2000处理分离到17株细菌,1株为芽孢杆菌,1株为气单胞菌。从本试验的结果可知,饲料中添加200mg/kg的棉子糖和4g/kg的半乳寡糖有利于芽孢杆菌的生长,同时抑制了气单胞菌的生长。4、试验四主要采用PCR结合变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析半乳寡糖作为饲料添加剂对饲喂初期、8周和16周花鲈肠道细菌多样性的影响。肠道细菌16S rDNA序列特征片段V3区序列经DGGE后,发现花鲈肠道内容物中细菌的多样性较丰富。结果表明,(1)8周,各试验组均能保持原生菌假单胞菌在肠道中定植,但到16周,假单胞菌从所有处理组肠道中消失;(2)除了8周G2处理肠道中没有肠杆菌外,8周其他各个处理和16周所有处理花鲈肠道中均存在肠杆菌;(3)从初期、8周和16周,G8和G20处理组均能够促进原生菌寡养单胞菌在肠道中定植;(4)16周时,G8和G20处理组出现克雷伯氏菌;(5)8周时,各个处理花鲈肠道中出现假交替单胞菌,但到16周时,仅各试验组肠道均分离到假交替单胞菌,可见,各试验组能够促进这种外源假交替单胞菌在肠道中定植。5、试验五采用PCR结合变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析棉子糖作为饲料添加剂对饲喂初期、8周和16周花鲈肠道细菌多样性的影响。肠道细菌16S rDNA序列特征片段V3区序列经DGGE后,发现花鲈肠道内容物中细菌的多样性较丰富。结果表明,(1)8周除了R800处理组外的其他处理和16周的所有处理组均分离到了原生菌假交替单胞菌,可见,饲料中添加棉子糖能够促进其在肠道中定植;(2)在8周短期的饲喂添加棉子糖的花鲈,其肠道中能够保持原生菌寡养单胞菌和假单胞菌在肠道中定植,但是到16周,这两种菌属在各个处理组肠道中均消失;(3)在饲料中添加棉子糖能够改变肠道微生物的组成,在R800处理组始终没有黄杆菌和放线细菌的存在,因此,推断出800mg/kg的棉子糖能够改善肠道微生物种类。
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全文目录
摘要 7-9 Abstract 9-16 第一章 绪论 16-23 1.1 前言 16 1.2 益生素及其应用效果的研究进展 16-19 1.2.1 益生素概念及功能特点 16-18 1.2.1.1 益生素概念 16-17 1.2.1.2 益生素的种类和特点 17-18 1.2.2 益生素的作用机理 18-19 1.3 益生素的应用效果研究 19-21 1.3.1 国内研究 19-20 1.3.2 国外研究 20-21 1.4 研究目的与意义 21-22 1.5 试验技术路线 22-23 第二章 半乳寡糖对花鲈生长、免疫及抗应激能力的影响 23-32 2.1 前言 23 2.2 材料和方法 23-26 2.2.1 鱼种和养殖系统以及试验设计 23-24 2.2.2 试验饲料和材料 24-25 2.2.3 应激指标 25 2.2.4 呼吸爆发(NBT) 25 2.2.5 细菌攻毒 25-26 2.2.6 计算公式及数据分析 26 2.3 结果 26-29 2.3.1 生长性能 26-27 2.3.2 非特异性免疫 27-28 2.3.3 空气暴露应激 28-29 2.3.4 NBT 29 2.3.5 细菌攻毒 29 2.4 讨论 29-31 2.5 小结 31-32 第三章 棉子糖对花鲈生长、免疫及抗应激能力的影响 32-40 3.1 前言 32 3.2 材料和方法 32-35 3.2.1 试验饲料 32-33 3.2.2 试验鱼和养殖系统 33-34 3.2.3 空气暴露应激试验及样品采集 34 3.2.4 嗜水气单胞菌攻毒 34 3.2.5 检测分析 34 3.2.6 计算公式及数据统计 34-35 3.3 结果 35-37 3.3.1 生长性能 35-36 3.3.2 非特异性免疫及抗氧化性能 36 3.3.3 空气暴露应激 36-37 3.3.4 细菌攻毒 37 3.4 讨论 37-39 3.5 小结 39-40 第四章 花鲈肠道细菌的分离培养与鉴定 40-58 4.1 前言 40 4.2 试验材料 40-42 4.2.1 鱼苗 40 4.2.2 饲料配方和试验设计 40-41 4.2.3 试验仪器和设备 41 4.2.4 肠道细菌的培养、分离和纯化 41-42 4.3 试验方法 42 4.3.1 菌种总DNA 抽提 42 4.3.2 16S RDNA 全长序列PCR 42 4.3.3 扩增性 RDNA 限制性酶切片段分析(ARDRA) 42 4.3.4 连接、转化与克隆 42 4.3.5 系统进化树的构建和分析 42 4.4 数据统计 42-43 4.5 结果 43-45 4.5.1 饲料中添加棉子糖试验的结果 43-44 4.5.2 饲料中添加半乳寡糖试验的结果 44-45 4.6 讨论 45-47 4.7 小结 47-58 第五章 利用PCR-DGGE 分析半乳寡糖对花鲈肠道细菌多样性影响 58-78 5.1 前言 58-59 5.2 试验材料 59 5.2.1 鱼苗 59 5.2.2 饲料配方和试验设计 59 5.2.3 肠道样品 59 5.3 试验方法 59-61 5.3.1 肠道细菌DNA 的抽提 59-60 5.3.2 肠道细菌16SRDNA 全长序列PCR 60 5.3.3 细菌16SRDNA V3 序列 PCR 60 5.3.4 DGGE 分离 60 5.3.5 DGGE 条带的切割以及克隆和测序 60 5.3.6 肠道细菌16S RDNA 序列的测定 60-61 5.3.7 16S RDNA 序列分析 61 5.4 结果 61-63 5.4.1 肠道细菌 DNA 提取和16S RDNA V3 区序列PCR 61 5.4.2 16S RDNA V3 区序列DGGE 指纹图谱 61-62 5.4.3 DGGE 凝胶中 DNA 条带序列菌属关系和系统发育分析 62-63 5.5 讨论 63-65 5.6 小结 65-78 第六章 利用PCR-DGGE 分析棉子糖对花鲈肠道细菌多样性的影响 78-96 6.1 前言 78-79 6.2 试验材料 79 6.2.1 鱼苗 79 6.2.2 饲料配方和试验设计 79 6.2.3 肠道样品 79 6.3 试验方法 79-81 6.3.1 肠道细菌DNA 的抽提 79 6.3.2 肠道细菌16SRDNA 全长序列PCR 79-80 6.3.3 细菌16SRDNA V3 序列 PCR 80 6.3.4 DGGE 分离 80 6.3.5 DGGE 条带的切割以及克隆和测序 80 6.3.6 肠道细菌16S RDNA 序列的测定 80 6.3.7 16S RDNA 序列分析 80-81 6.4 结果 81-83 6.4.1 肠道细菌DNA 提取和16S RDNA V3 区序列 PCR 81 6.4.2 16S RDNA V3 区序列DGGE 指纹图谱 81-82 6.4.3 DGGE 凝胶中 DNA 条带序列菌属关系和系统发育分析 82-83 6.5 讨论 83-85 6.6 小结 85-96 第七章 全文结论 96-97 7.1 主要结论 96 7.2 本研究的创新之处 96 7.3 尚需深入研究的问题 96-97 参考文献 97-108 致谢 108-109 作者简历 109
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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产养殖技术 > 水产动物饵料及其营养
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