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基于石墨烯构建新型生物传感器的研究

作　者: 叶宗煌
导　师: 李根喜
学　校: 南京大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 生物传感器电化学氧化石墨烯胰蛋白酶硫堇纳米器件腺苷三磷酸适体功能化金纳米颗粒阳极氧化铝膜核酸分析比色法检测紫外-可见光谱分析循环伏安法计时库仑法交流阻抗法
分类号: TP212.3
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

生物传感器是利用生物材料(包括酶,抗体,核酸,细胞,组织等)结合物理化学方法对被测物进行检测的装置。生物传感器具有灵敏度高、特异性强、可实现实时检测等优点,在临床检验、环境监测、以及生命科学研究等领域具有广泛的应用价值。石墨烯(graphene)是由碳原子蜂巢状排列构成的具有单层原子厚度的新型片状结构二维材料,它具有独特的电子学、光学、机械、热学以及电化学特性,基于石墨烯构建新型生物传感器,不仅丰富了传感器的构建材料,而且,借助石墨烯特有的性质,可以研制许多新型的生物传感器,本论文正是基于此开展了一些工作,并取得了一些结果,具体如下。1.基于氧化石墨烯和脱氧核酶构建双信号比色法DNA传感器本章中,利用氧化石墨烯和过氧化物酶类似核酶,作者提出了一种新型的具有双重信号输出的策略构建了DNA比色法传感器。该设计中的双功能DNA探针整合了过氧化物酶类似核酶序列和目标DNA的互补序列。探针的目标DNA互补序列可以通过π-π堆叠作用吸附到氧化石墨烯表面；然而,当存在目标DNA时,石墨烯-DNA探针相互作用遭到破坏,导致离心分离后,过氧化物酶活性探针从石墨烯沉淀转移到上清当中,因此,上清中可以得到该核酶催化产生的比色信号,通过肉眼简单观察沉淀或者上清催化反应的颜色深浅变化,就可以达到检测目标DNA的目的。另外,通过对双重比色信号(沉淀中为“信号-关”,上清中为“信号-开”)进行数学运算,可以大大提高该传感器的效能。2.基于氧化石墨烯与核酸适体功能化金纳米颗粒构建比色法ATP生物传感器本章中,作者利用核酸适体功能化金纳米颗粒与氧化石墨烯之间的相互作用,构建了新型比色法ATP传感器。当溶液中没有ATP时,金纳米颗粒借助表面修饰的核酸适体吸附到二维氧化石墨烯平面的两侧,最终形成超级夹心三明治结构而沉淀析出。然而,当检测体现中存在ATP时,适体结合ATP发生折叠,金纳米颗粒则不会结合到石墨烯上,因而稳定存在于溶液之中,因此作者使用金纳米颗粒和氧化石墨烯构建了比色法ATP传感器。该传感器可以通过紫外-可见光谱分析,甚至可以直接用肉眼观测达到检测ATP的目的,而通过改变金纳米颗粒上修饰的适体,该传感器还有望发展成为用于DNA、金属离子、小分子、蛋白质等多种物质检测的生物传感器。3.基于硫堇-石墨烯复合物构建胰蛋白酶电化学生物传感器本章中,作者利用多肽和石墨烯的相互作用构建了一种简单的无标记胰蛋白酶电化学传感器。作者设计了一段胰蛋白酶的底物多肽,这条多肽通过C末端半胱氨酸修饰在金电极表面,其N末端的组氨酸则可以通过π-π作用及静电作用吸附石墨烯,然而,当检测体系中存在胰蛋白酶时,多肽序列经过酶消化,暴露出来的丝氨酸残基与石墨烯的作用非常微弱,因而导致石墨烯无法吸附在电极表面,通过检测吸附在石墨烯表面报告分子(硫茧)的电化学信号,作者因此研制了一种基于硫堇-石墨烯复合物的胰蛋白酶电化学生物传感器。由于石墨烯具有较大的比表面积,具有巨大的负载能力,因而可以吸附大量报告分子,具有信号放大的作用,因此,该传感器可以具有很高的灵敏度。此外,该传感器不仅操作简便,无需特殊标记,而且,通过改变切割的序列,还可以设计成用于其它蛋白酶检测的传感器。4.基于DNA功能化石墨烯构建小分子三维“纳米避难所”电极界面的纳米组装结构可以赋予电极更多功能,作者利用DNA功能化氧化石墨烯,在电极表面搭建了三维“纳米避难所”结构用于保护信号分子。实验中,作者首先将DNA1利用金巯键固定在金电极表而,然后加入DNA2功能化的氧化石墨烯,通过一段与DNA1和DNA2均存在部分互补的连接DNA将上述分子连接到电极表面,形成以氧化石墨烯为顶棚,DNA为支柱的三维“纳米避难所”结构。随后,作者选取一个有电化学活性的小分子,研究其进出“纳米避难所”的扩散过程,结果表明,“纳米避难所”可以明显阻挡电化学活性小分子从本体溶液进入避难所内部,同时,反向的过程也受到削弱。因此,“纳米避难所”可以延长电化学活性小分子的保留时间,并且阻挡外界的干扰,从而提高检测的灵敏度和特异性,为发展新型生物传感器打下了基础。5.基于氧化石墨烯和阳极氧化铝膜构建小分子响应的智能膜开关本章中,作者利用ATP适体和氧化石墨烯设计了一种ATP响应的智能膜开关。作者结合氧化石墨烯,以适体作为新型的识别及响应元件,首先将ATP适体修饰在喷金的阳极氧化铝表面。当检测体系中没有ATP存在时,修饰的ATP适体可以通过π-π作用吸附氧化石墨烯,从而封闭膜表面的孔道,阻止分子通过,膜为闭合状态。然而,当膜预先和ATP作用,适体结合ATP,不再结合氧化石墨烯时,膜为开放状态。实验结果表明,膜对ATP有良好响应,并且对膜孔的调节与ATP的浓度相关,因而可以实现连续调控。此外,考虑到适体的多样性,选取不同的适体序列,可以开发出响应不同分子的膜开关,拓展该体系的应用范围,为发展新型生物传感器创造了条件。

全文目录

中文摘要  10-13
ABSTRACT  13-17
论文的主要创新点  17-18
绪论  18-56
  1 石墨烯研究发展史概述  18-19
  2 石墨烯的性质  19-20
  3 石墨烯的制备和表征  20-23
    3.1 石墨烯的制备方法  20-22
    3.2 石墨烯的表征方法  22-23
  4 石墨烯的功能化  23-25
    4.1 共价修饰  24
    4.2 非共价修饰  24-25
  5 石墨烯在生物传感器中的应用  25-37
    5.1 基于石墨烯的光学传感器  25-30
    5.2 基于石墨烯的电化学传感器  30-36
    5.3 基于石墨烯的场效应晶体管传感器  36-37
  6 生物传感中的电化学技术简介  37-43
    6.1 电化学三电极系统  37-39
    6.2 常用电化学技术  39-43
  7 本论文的主要研究内容  43-44
  参考文献  44-56
第一章基于氧化石墨烯和脱氧核酶构建双信号比色法DNA传感器  56-72
  1.1 引言  56-57
  1.2 实验部分  57-59
    1.2.1 实验试剂  57-58
    1.2.2 实验仪器  58
    1.2.3 具有催化活性的氧化石墨烯-探针DNA复合物的制备  58-59
    1.2.4 目标DNA的检测  59
    1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳  59
  1.3 结果与讨论  59-66
    1.3.1 实验原理  59-60
    1.3.2 检测平台的可行性研究  60-61
    1.3.3 氧化石墨烯表面催化活性的探针DNA装载量的研究  61-63
    1.3.4 目标DNA检测  63-64
    1.3.5 盐离子浓度影响  64-65
    1.3.6 检测平台特异性研究  65-66
  1.4 结论  66-67
  参考文献  67-72
第二章基于氧化石墨烯与核酸适体功能化金纳米颗粒构建比色法ATP传感器  72-87
  2.1 引言  72-73
  2.2 实验部分  73-75
    2.2.1 实验试剂  73
    2.2.2 实验仪器  73-74
    2.2.3 金纳米颗粒的制备  74
    2.2.4 金纳米颗粒的表征  74
    2.2.5 ATP适体功能化金纳米颗粒的制备  74-75
    2.2.6 氧化石墨烯与功能化金纳米颗粒相互作用的比色分析  75
  2.3 结果与讨论  75-82
    2.3.1 实验原理  75-76
    2.3.2 金纳米颗粒的表征  76
    2.3.3 金纳米颗粒的修饰情况表征  76-77
    2.3.4 实验可行性研究  77-79
    2.3.5 沉淀析出的影响因素  79-80
    2.3.6 ATP的检测  80
    2.3.7 检测体系的特异性  80-82
  2.4 结论  82
  参考文献  82-87
第三章基于硫堇—石墨烯复合物构建胰蛋白酶电化学生物传感器  87-102
  3.1 引言  87-88
  3.2 实验部分  88-90
    3.2.1 实验试剂  88
    3.2.2 实验仪器  88-89
    3.2.3 硫堇-石墨烯复合物的制备及表征  89
    3.2.4 多肽修饰电极的制备  89
    3.2.5 电化学检测胰蛋白酶  89-90
  3.3 结果与讨论  90-97
    3.3.1 实验原理  90-91
    3.3.2 硫堇-石墨烯复合物的表征  91-92
    3.3.3 实验可行性研究  92-93
    3.3.4 传感器构建过程的电化学表征  93-94
    3.3.5 胰蛋白酶酶切时间优化  94-95
    3.3.6 胰蛋白酶酶活检测  95
    3.3.7 检测体系特异性  95-97
  3.4 结论  97
  参考文献  97-102
第四章基于DNA功能化石墨烯构建小分子三维“纳米避难所”  102-117
  4.1 引言  102-103
  4.2 实验部分  103-106
    4.2.1 实验试剂  103
    4.2.2 实验仪器  103-104
    4.2.3 氧化石墨烯-DNA复合物的制备  104
    4.2.4 红外表征  104
    4.2.5 DNA修饰电极的制备  104-105
    4.2.6 “纳米避难所”构建  105
    4.2.7 电化学检测  105-106
  4.3 结果与讨论  106-113
    4.3.1 实验原理  106
    4.3.2 氧化石墨烯-DNA复合物的表征  106-108
    4.3.3 “纳米避难所”组装过程的表征  108-109
    4.3.4 连接DNA浓度优化  109-110
    4.3.5 “纳米避难所”对小分子流入的影响  110-111
    4.3.6 “纳米避难所”对小分子流出的影响  111-113
    4.3.7 讨论  113
  4.4 结论  113-114
  参考文献  114-117
第五章基于氧化石墨烯和阳极氧化铝膜构建小分子响应的智能膜开关  117-131
  5.1 引言  117-118
  5.2 实验部分  118-120
    5.2.1 实验试剂  118
    5.2.2 实验仪器  118-119
    5.2.3 金纳米颗粒制备  119
    5.2.4 ATP适体修饰阳极氧化铝膜的制备  119
    5.2.5 阳极氧化铝膜开关的构建  119
    5.2.6 阳极氧化铝膜开关截留率测定  119-120
  5.3 结果与讨论  120-126
    5.3.1 实验原理  120-121
    5.3.2 阳极氧化铝膜开关的AFM表征  121-122
    5.3.3 水流滤过性实验研究  122
    5.3.4 氧化石墨烯浓度优化  122-123
    5.3.5 阳极氧化铝膜开关对ATP响应情况研究  123-124
    5.3.6 阳极氧化铝膜开关对不同分子截留率研究  124-125
    5.3.7 阳极氧化铝膜开关响应特异性研究  125-126
  5.4 结论  126
  参考文献  126-131
全文总结与展望  131-133
  1 全文总结  131-132
  2 展望  132-133
附录  133-135
致谢  135-136

基于石墨烯构建新型生物传感器的研究

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