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土霉素高效降解菌降解特性比较及土壤环境模拟试验

作　者: 陈海宁
导　师: 王志强
学　校: 扬州大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 土霉素细菌土壤降解特性
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文建立了无机盐培养基和土壤中土霉素含量检测的HPLC方法,样品采用Mcllvaine缓冲液为土霉素提取剂,以乙腈:KH2PO4溶液(0.05mol/L)(18:82,V/V)为流动相、pH值3.0,在波长355nm,柱温30℃,流速1.0mL/min的条件下进行HPLC分析。土霉素在培养基和土壤中的平均回收率分别高于85%和80%,日内、日间变异系数低于10%, LOD和LOQ分别为0.01mg/L和0.1mg/L。以相对贫乏的培养基作为限制性条件构建细菌筛选模型,经初步筛选、分离纯化、细菌驯化等方法最终筛选出两株土霉素高效降解菌,结合革兰氏染色镜检和分子生物学16S rDNA鉴定,确定细菌为粘质沙雷氏菌和阴沟肠道杆菌。将粘质沙雷氏菌、阴沟肠道杆菌和蜡样芽孢杆菌在同一条件下比较研究(试验中分别命名为1号菌、2号菌和3号菌),从pH值、温度、通气量、底物浓度、细菌接种量、外加碳(氮)源、金属离子等方面比较研究了细菌对土霉素降解作用及这些因素对细菌生长量的影响,最终确定各种细菌最佳降解条件:1号菌在pH值为8、35℃、通气量100mL、细菌接种浓度0.1%、底物浓度150mg/L、添加0.2%淀粉、1%酵母、Fe3+和Zn2+的条件下土霉素降解速率最高;2号菌在pH值为9、30℃、通气量60mL、细菌接种浓度5%、底物浓度100mg/L、添加0.2%淀粉、1%牛肉膏、Fe3+和Zn2+的条件下土霉素降解速率最高;3号菌在pH值为7、35℃、通气量80mL、细菌接种浓度0.1%、底物浓度50mg/L、添加0.2%淀粉、0.5%酵母、Fe3+和Zn2+的条件下土霉素降解速率最高。将三种细菌在试验室进行土壤环境模拟试验,试验分灭菌土壤组和非灭菌土壤组,并选择10mg/kg、25mg/kg和50mg/kg三个浓度进行试验,在智能光照培养箱中25℃、光照强度6500勒克斯、光暗比12h:12h连续培养60d,最终确定了最佳降解时间为20d-40d。此外,本试验还初步研究了三种细菌对四环素类药物多西环素的降解情况,试验结果表明,细菌对多西环素没有降解能力。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-12
符号说明  12-14
第一章文献综述  14-22
  1 抗生素使用对环境的影响  14-15
  2 四环素类抗生素的研究进展  15-18
    2.1 土霉素的理化性质  15-16
    2.2 四环素类抗生素的环境行为  16
    2.3 四环素类抗生素的生态毒性  16-18
  3 生物降解的研究进展  18-20
  4 研究目的及意义  20-22
第二章土霉素分析检测方法的确立  22-34
  1 试验材料  22-25
    1.1 土壤来源  22
    1.2 药品及试剂  22-23
    1.3 仪器及其它  23-24
    1.4 试液配制  24-25
  2 方法  25-28
    2.1 高效液相色谱法  25-28
  3 结果  28-32
    3.1 HPLC 法结果  28-32
      3.1.1 HPLC 法标准曲线  29-30
      3.1.2 回收率  30-31
        3.1.2.1 无机盐培养基中土霉素的回收率  30
        3.1.2.2 土壤中土霉素的回收率  30-31
      3.1.3 精密度  31-32
  4 讨论  32-34
    4.1 检测方法的选择  32
    4.2 检测条件和样品处理条件的优化  32-34
第三章土霉素高效降解菌的筛选  34-45
  1 试验材料  34-37
    1.1 土壤来源  34-35
    1.2 药品及试剂  35
    1.3 仪器及其它  35
    1.4 试液配制  35-37
      1.4.1 土霉素母液A  35
      1.4.2 土霉素母液B  35-36
      1.4.3 普通培养基  36
      1.4.4 富集培养基  36
      1.4.5 无机盐培养基  36
      1.4.6 筛选培养基  36
      1.4.7 草酸铵结晶紫染色液  36
      1.4.8 革兰氏碘液  36-37
      1.4.9 番红水溶液  37
      1.4.10 95%酒精  37
  2 方法  37-41
    2.1 样品采集  37
    2.2 样品处理  37
    2.3 富集培养  37
    2.4 分离纯化  37
    2.5 菌株的筛选  37-38
    2.6 菌株的复筛  38
    2.7 菌株的鉴定  38-41
      2.7.1 菌株的显微观察  38
      2.7.2 细菌的分子生物学鉴定  38-41
  3 结果  41-43
    3.1 菌株的筛选结果  41
    3.2 菌株的鉴定结果  41-43
  4 讨论  43-45
    4.1 细菌的筛选结果  43-44
    4.2 细菌的鉴定结果  44-45
第四章土霉素高效降解菌的降解特性比较  45-61
  1 试验材料  45-46
    1.1 细菌来源  45
    1.2 药品及试剂  45
    1.3 仪器及其它  45
    1.4 试液配制  45-46
  2 方法  46-48
    2.1 细菌悬液浓度的测定  46
    2.3 初始pH 值对细菌生长及土霉素降解速率的影响  46-47
    2.4 温度对细菌生长及土霉素降解速率的影响  47
    2.5 装样量对细菌生长及土霉素降解速率的影响  47
    2.6 底物浓度对细菌生长及土霉素降解速率的影响  47
    2.7 细菌接种浓度对细菌生长及土霉素降解速率的影响  47-48
    2.9 金属离子对细菌生长及土霉素降解速率的影响  48
    2.10 细菌对土霉素降解的动力学曲线比较  48
  3 结果  48-59
    3.1 细菌悬液浓度结果  48
    3.2 初始pH 值对细菌生长及土霉素降解速率的影响  48-49
    3.3 温度对细菌生长及土霉素降解速率的影响  49-51
    3.4 装样量对细菌生长及土霉素降解速率的影响  51-52
    3.5 底物浓度对细菌生长及土霉素降解速率的影响  52-53
    3.6 细菌接种浓度对细菌生长及土霉素降解速率的影响  53-55
    3.7 添加不同碳、氮源对细菌生长及土霉素降解速率的影响  55-57
    3.8 金属离子对菌株生长及降解活性的影响  57-59
  4 讨论  59-61
第五章土霉素高效降解菌的土壤环境模拟试验  61-68
  1 试验材料  61-62
    1.1 供试土壤  61
    1.2 药品及试剂  61
    1.3 仪器及其它  61-62
  2 方法  62
    2.1 土壤处理方法  62
    2.2 土霉素母液配制  62
    2.3 试验方法  62
  3 结果  62-66
  4 讨论  66-68
第六章土霉素降解菌对多西环素的降解  68-76
  1 试验材料  68-69
    1.1 药品及试剂  68
    1.2 仪器及其它  68
    1.3 试液配制  68-69
  2 方法  69-71
    2.1 采样方法  69
    2.2 样品处理方法  69
    2.3 HPLC 测定条件  69-70
    2.4 标准曲线和线性范围的测定  70
    2.5 多西环素的提取回收率测定  70
    2.6 定量方法  70
    2.7 定性方法  70-71
  3 结果  71-73
    3.1 色谱行为  71-72
    3.2 标准曲线及线性范围  72
    3.3 回收率  72-73
    3.4 降解率  73
  4 讨论  73-76
    4.1 多西环素检测条件和样品处理方法的优化  73-75
    4.2 细菌对多西环素的降解率  75-76
全文结论  76-77
参考文献  77-84
致谢  84

土霉素高效降解菌降解特性比较及土壤环境模拟试验

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