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血小板裂解液对组织工程心脏瓣膜体外构建作用的实验研究

作　者: 张进闯
导　师: 付庆林
学　校: 新乡医学院
专　业: 外科学
关键词: 骨髓间充质干细胞组织工程心脏瓣膜血小板裂解液黏附
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：组织工程心脏瓣膜(the tissue engineered heart valves,TEHV)的构建是将种子细胞成功地种植到瓣膜支架上,从而进一步构建成具有细胞生长的组织工程心脏瓣膜。细胞和支架之间的相互作用,如细胞在支架上的迁移、分化、增殖等,都是以细胞和支架的黏附为基础。研究发现,体外种植、培养所形成的组织工程心脏瓣膜的种子细胞黏附力较低,而且生理功能与正常细胞相比明显不足。因此,如何促进种子细胞与瓣膜支架粘附,进而分化、增殖仍是THEV体外构建的关键所在。血小板裂解上清液(platelet lysates,PL)富含许多生长因子如：血小板衍生生长因子、转化生长因子p1、胰岛素样生长因子和血管内皮细胞因子等。生长因子能够发挥最大生物效应,依靠多种生长因子之间的相互调节,很多研究表明单因子对组织修复作用有限。目的：将大鼠骨髓干细胞种植于去细胞猪主动脉瓣膜支架上,体外构建组织工程心脏瓣膜。通过改变静态培养的环境条件,观察大鼠BMSCs在支架上的黏附、生长情况及体外构建的TEHV进行冲刷实验,从而评价PL促进并增强种子细胞黏附力的效果。方法：(一)大鼠BMSCs的分离,培养及鉴定：使用全骨髓分离培养法,DMEM-F12培养液体外培养扩增。采用相应的流式抗体CD34-FITC、HLA-DR-PE、 CD45-PERCT、CD90-FITC进行细胞表型鉴定。(二)PL的制备：参照宋会平等方法以3次离心结合反复冻融法制备血小板裂解液。10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3ml/100g),自大鼠心内采血6mL,肝素抗凝,室温下150g离心10min。取上清和血小板层细胞室温下1500g再次离心10min获取沉淀的血小板,用2mLPBS液(PH7.2)重悬。连续反复冻融(-80℃/37℃)5次,4℃下8000g离心30min去除血小板膜和其他细胞残片,-80℃冻存备用。(三)PL促进大鼠BMSCs在瓣膜支架上的分裂及黏附力的研究1、组织工程心脏瓣叶的制备：采用0.25%Trition、025%的脱氧胆酸钠、0.02%的EDTA、RNA酶和DNA酶溶液,37摄氏度震荡48小时进行去细胞处理,通过组织学切片、电镜检查观察去细胞效果。采用去细胞猪主动脉瓣叶作支架,分A(10%FBS-DMEMF-12)、B (10%FBS-DMEMF-12-25%PL)、C(10%FBS-DMEMF-12-5%PL)和D (10%FBS-DMEMF-12-75%PL)4组,每组16个瓣叶,BMSCs作为种子细胞,体外构建TEHV,于构建后第7天通过瓣叶上BMSCs的光镜计数、MTT法、组织切片、电镜检查等进行瓣叶上BMSCs的黏附、生长状态的变化。2、TEHV的体外冲刷实验：实验分2大组,为静态组和实验组,每组再分4组,分别为A、B、C、D,每组16个瓣叶。构建后进行MTT检测及瓣叶细胞计数。实验组第7天进行冲刷实验,持续24小时。通过瓣叶上BMSCs光镜计数、MTT法、组织切片等检查观察BMSCs的存留情况。结果：1、用全骨髓培养法获得的大鼠骨髓间充质干细胞经原代培养和连续传代后,呈梭形、指数增殖,细胞形态有多形性逐渐趋向一致。流式细胞仪分析CD45、 HLA-DR阴性率达,CD34、CD90阳性率达,符合骨髓间充质干细胞的表型特征。2、HE染色：HE染色显示采用曲拉通法能够完全去除猪主动脉瓣叶上的细胞成分,脱细胞处理的猪主动脉瓣叶为白色半透明,质地柔软,未见细胞及细胞碎片成分,纤维网结构基本完整。新鲜猪主动脉瓣叶中可见许多蓝色深染的细胞核及正常瓣叶结构,未见明显空白区域。3、用大鼠BMSCs构建的TEHV瓣叶HE染色显示B组、C组和D组的BMSCS在去细胞瓣叶表面呈复层生长,形成连续细胞层。而A组,虽然在瓣膜表面形成了细胞层,但细胞与基质黏附不紧,有的部位没有细胞覆盖。透射电镜显示,去细胞瓣叶的纤维结构保存完整。MTT法和细胞计数显示D三组瓣叶上黏附的细胞数明显多于C、B、A组,而C、D两组又明显多于B组。4、TEHV的体外冲刷实验后,细胞计数和MTT示A组、B组在遭遇高速流体冲刷后的细胞计数[分别为(2.25±0.28)×104、(2.93±0.28)×104]少于C、D2组[(3.56±0.31)×104、(4.68±0.46)×104](p<0.05),D组细胞数明显多于A、B、C3组(p<0.05),提示该实验有检验细胞黏附力的价值。同时HE染色显示冲刷试验后细胞存留的较少,C、D组瓣膜表面存留细胞密度多于A、B2组。结论：1、采用曲拉通法能够较好去除猪主动脉瓣膜上的细胞2、PL能够促进BMSCs在瓣叶支架上的增殖及黏附能力,并随着其浓度的增加而增强,7.5%PL浓度较为理想。

全文目录

摘要  6-9
ABSTRACT  9-11
前言  11-14
1. 材料与方法  14-23
  1.1 研究对象  14
    1.1.1 动物选择  14
    1.1.2 分组  14
  1.2 实验模型建立  14-17
    1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞获取  14-15
    1.2.2 大鼠骨髓间充质干细胞培养  15
    1.2.3 大鼠骨髓间充质干细胞鉴定  15-16
    1.2.4 BMSCs的冻存及复苏实验  16
    1.2.5 血小板裂解液的制备  16-17
    1.2.6 去细胞猪主动脉瓣叶支架的制备  17
    1.2.7 骨髓间充质干细胞种植于去细胞主动脉瓣叶支架  17
  1.3 主要仪器及试剂  17-19
    1.3.1 主要仪器设备(本实验所用实验设备均由河南省神经病学研究所提供)  17-18
    1.3.2 主要试剂  18-19
    1.3.3 主要缓冲液与工作液  19
  1.4 研究方法  19-22
    1.4.1 石蜡切片制作  20
    1.4.2 观察病理学变化  20
    1.4.3 透射电镜(TEM)样品的制备  20-21
    1.4.4 构建好的TEHV细胞计数  21
    1.4.5 THEV的MTT检测  21-22
    1.4.6 THEV的体外冲刷实验  22
  1.5 统计学分析  22-23
2. 结果  23-27
  2.1 大鼠BMSCs形态学观察及生长曲线的测定  23
  2.2 大鼠BMSCs的流式细胞仪鉴定结果  23
  2.3 HE染色镜下观察  23-24
  2.4 电镜观察  24
  2.5 种植后第7天瓣叶上细胞数和MTT检测结果  24-25
  2.6 体外冲刷实验后瓣叶上存留的细胞数和MTT检测结果  25-27
3. 讨论  27-34
  3.1 组织工程心脏瓣膜种子细胞的来源  27-28
  3.2 组织工程心脏瓣膜支架材料的选择  28-29
  3.3 瓣膜支架的去细胞方法  29
  3.4 瓣膜种子细胞种植方法  29-30
  3.5 组织工程心脏瓣膜的构建  30-31
  3.6 组织工程心脏瓣膜与临床的研究  31
  3.7 血小板裂解液的研究  31-32
  3.8 血小板裂解液的制备过程  32
  3.9 体外冲刷实验检测细胞黏附力的研究  32-33
  3.10 本课题的创新之处  33-34
4. 结论  34-35
附图  35-43
参考文献  43-46
综述  46-55
  参考文献  52-55
英文缩写词汇表  55-56
攻读学位期间发表文章情况  56-57
致谢  57-58
个人简历  58

血小板裂解液对组织工程心脏瓣膜体外构建作用的实验研究

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