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三种猪源性细胞外基质体内降解规律的实验研究

作　者: 姜岩
导　师: 王强
学　校: 第二军医大学
专　业: 外科学
关键词: 细胞外基质降解弹性纤维葡糖氨基聚糖类胶原
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景:复杂腹壁缺损的修复仍然是再生医学领域的一个巨大难题，对这项难题的认识是每一位外科医生所面临的共同问题，于是腹壁缺损的再造便成为学者们近些年来研究的热点问题之一，临床上众多学科频繁的交流合作以寻求腹壁缺损再造的最佳方法，例如：普通外科、整形外科以及创伤外科等，然而即使我们不懈的努力，组织缺损的部位也很难达到理想的修复效果，术后病人的生活质量也远不如预想的好。为解决这一难题，人们一方面着眼于外科手术技巧的改良，另一方面，为寻找最适合于腹壁修复的材料而进行着探索。人们在探索的过程中逐渐认识到，三维空间结构对组织的重建起到非常重要的作用，这种特殊的空间结构能够在组织修复的过程中控制细胞的功能，又能够促进修复区形成新的组织。因为三维空间结构能够为干细胞等提供原始传代场所，使这些细胞能够在恰当的地方聚集，并为这些细胞的粘附、迁移、增值和分化提供生物活性物质，随着材料植入病人体内时间的延长，材料本身会逐步完成降解，被新生的组织结构取代，从而完成腹壁缺损的修复过程，因此，理想的腹壁修复材料应该具有生物相容性、可降解性等优点，还要能够为干细胞提供生物活性肽等成份。以上种种特殊的使用条件，进一步推动了生物补片在医学界的发展和应用，近些年来，人们找到一种具备上述所有特点的一种腹壁修复材料——细胞外基质（ECM）。细胞外基质（ECM）一直以来都被视为一种天然的、理想的生物支架材料。细胞外基质的构造是利用组织或器官自身的细胞来实现的，因此，它能够和周围的微环境形成一种动态平衡状态。细胞外基质独特的分子结构，能够促使机体内相邻的细胞相互作用，此外，它还能够为血管、神经和淋巴管等提供一个支持性的介质或渠道，使营养物质能够顺利的从血液扩散到周围的组织或细胞中去。总而言之，细胞外基质具备了组织工程支架材料的所有优点。细胞外基质是自身组织细胞分泌形成的功能性分子结构，因此，由于组织来源的不同，细胞外基质的组成成份也存在差异。来源于小肠粘膜下层的细胞外基质材料（SIS-ECM）是最常被用到的，而成为细胞外基质的代表。干燥状态下的SIS，其90%的成份是胶原，其中以Ⅰ型为主，另外，还有少量的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ型胶原；膀胱细胞外基质材料（UBM-ECM）与SIS的组成成份类似,但UBM中Ⅲ型胶原和Ⅶ型胶原共同存在，且后者是上皮基底膜的重要组成成份，这就使UBM和SIS在组成成份上明显区别于其他组织来源的支架材料。SIS中包含了多种胶原、葡糖氨基聚糖类（GAGs）,生长因子等。GAGs在细胞外基质内含量的高低与脱细胞的方法有关，例如，去离子剂是脱细胞过程中经常用到的一种试剂，但这种试剂在脱细胞的同时，能够去除细胞外基质中的GAGs，从而使GAGs的含量减低。研究证实SIS内含有粘附分子，例如：蛋白聚糖、层粘连蛋白和巢蛋白等。SIS中还含有多种生长因子，包括转化生长因子、血管内皮生长因子等，研究证实，这些生长因子即使经过消毒处理或长期储存，依然具有生物活性。总而言之，细胞外基质是由多种不同的分子构成的一个整体结构，随着组织来源的不同，其功能也可能会有所区别。目前，我们尚未完全认识清楚细胞外基质所具有的三维组织结构，因此，在实验室条件下进行简单的合成是无法构建出细胞外基质材料的，但细胞外基质中所包含的重要物质成份，例如：胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和透明质酸等，可以用人工的方法进行分离提纯，而且已经证实这些重要成份无论在体内还是体外，都能够促进细胞生长和分化。各种各样的不同来源的细胞外基质，被作为一种支架材料，广泛的应用于组织或器官的重建，例如：来源于小肠、皮肤、肝脏、胰腺和膀胱等组织或器官。目前，诸如此类的细胞外基质材料已经形成商业化产品，并大范围的应用于临床，例如：由猪小肠粘膜下层制成的ECM Oasi（sHealthpoint公司）、Restore(DePuy公司)、CuffPatch(Arthrotek公司)，由人真皮制成的ECM Axis dermis（Mentor公司）、GraftJacket（Wright Medical Tech公司），由猪真皮制成的ECM Pelvicol（Bard公司）、Permacol（Tissue Science Laboratories公司）、Zimmer Collagen Patch（Tissue ScienceLaboratories公司），由牛心包制成的ECM Vascu-Guard（Synovis Surgical公司）、Peri-Guard（Synovis Surgical公司）、Dura-Guard（Synovis Surgical公司），都已由美国食品和药品管理局（US Food and DrugAdministration,FDA)批准上市，应用于简单或复杂的腹壁缺损的修补手术。目的:本实验以小鼠腹壁缺损为模型，通过对三种猪源性细胞外基质（ECM）—真皮基质（P-ADM）、心包基质(P-PC)以及猪小肠粘膜下层基质(P-SIS),体内弹性纤维、葡糖氨基聚糖类(GAGs)、Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量，以及Ⅰ/Ⅲ型胶原比例的测定，来对比研究三种生物材料植入体内后的降解规律。方法:第一部分：三种猪源性细胞外基质的制备及其术后病理学评估。1.利用国际上传统的脱细胞方法制备三种猪源性细胞外基质材料。2.动物实验：清洁级小鼠,数量共60只，约18-20g重，单笼喂养，建立小鼠腹壁全层缺损模型，随机分为3组（n=20），分别以同样大小的上述三种基质材料进行修复，于术后4周、8周进行取材评估。3.检测指标：（1）.动物术后一般情况。（2）.腹腔内粘连程度评分。（3）.组织病理学检测。第二部分：三种猪源性细胞外基质植入动物体内后降解规律的研究。1.动物实验：清洁级小鼠,数量共60只，约18-20g重，单笼喂养，建立小鼠腹壁全层缺损模型，随机分为3组（n=20），分别以同样大小的上述三种基质材料进行修复，于术后4周、8周进行取材评估。2.检测指标：弹性纤维、葡糖氨基聚糖类、Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量变化情况，以及Ⅰ/Ⅲ型胶原比例的变化情况。结果:实验动物术中因麻醉意外死亡1条，其余个体都得以存活，至术后8周时，三组材料修复区修复效果较好，未见瘘、感染等并发症。术后P-SIS组的腹腔内粘连评分均低于同时期内的其余两组。术后4、8周比较：P-ADM组，GAGs含量减少（P<0.01）；PC组，弹性纤维（P<0.01）、Ⅲ型胶原及GAGs数值上呈现上升趋势，后二者P值都是P<0.05；P-SIS组，弹性纤维（P<0.001）、GAGs（P<0.05）、Ⅰ型胶原（P<0.01）、及Ⅲ型胶原（P<0.05）数值上呈现上升趋势；且P-SIS组I、Ⅲ型胶原比例增加（P<0.01）。结论:P-SIS材料中，弹性纤维、GAGs及胶原的再生状况优于其他两组，且P-SIS材料不易引起腹腔内粘连，故P-SIS在组织工程学领域相对而言是更加理想的修复材料，具有更好应用前景。

三种猪源性细胞外基质体内降解规律的实验研究

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