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自体骨髓间充质干细胞外基质（ECM）支架在软骨组织工程中的应用研究
作 者: 唐成
导 师: 王黎明
学 校: 南京医科大学
专 业: 外科学
关键词: 自体 aBMSC-dECM支架 组织工程 支架 软骨再生 aBMSc-dECM支架 BMSCs 成软骨分化 软骨组织工程 骨髓刺激术
分类号: R318.08
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
下 载: 47次
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内容摘要
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第一部分aBMSC-dECM支架的制作及其性能研究目的探讨通过收集自体骨髓间充质干细胞外基质(autologous bone marrow mesenchymal stem cell-derived extracellular matrix, aBMSC-dECM)制备三维多孔状支架的可行性,并对支架性能进行分析。方法分离、培养2周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,原代培养4周后收集其分泌的aBMSC-dECM膜,采用交联和冻干技术制备三维多孔状支架,对支架行HE染色、扫描电镜、抗压强度测试。结果aBMSC-dECM支架呈三维多孔状海绵样结构,孔隙分布均匀且有较好的连通性,孔径大小为304.4±108.2μm；孔隙率为93.3%±4.5%；密度为28.7±1.4mg/ml;抗压强度为6.8±1.5KPa。结论通过收集aBMSC-dECM膜可用于制备组织工程支架,该支架材料具有理想的三维空间结构特征及力学特性,有望成为一种具有较高应用价值的组织工程支架。第二部分aBMSC-dECM支架在软骨再生中的应用目的探讨aBMSC-dECM支架在软骨再生中的应用可行性。方法分离、培养2周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,原代培养4周后收集其分泌的aBMSC-dECM膜,采用交联和冻干技术制备三维多孔状支架。分离培养自体软骨细胞并植入aBMSC-dECM支架,将细胞-支架复合物分别行体外和裸鼠皮下种植培养制备组织工程软骨,对照组使用atelocollagen支架。于种植后48h对细胞-支架复合物行Live-Dead染色。于体外培养1周、2周和4周后对组织工程软骨行组织学分析、Real-Time PCR和Western blotting检测。于体内植入1周、2周和3周后对组织工程软骨行大体观察、体积测量、组织学分析、生化成分分析及抗压强度测量。结果Live-Dead染色显示aBMSC-dECM支架内的软骨细胞维持较好的生物活性；与对照组相比,体外培养4周后aBMSC-dECM支架组组织工程软骨内基质含量更多、分布更均匀,特定基因和蛋白表达更高；体内植入3周,aBMSC-dECM支架组组织工程软骨的体积增长和均质性均优于对照组,具有更高软骨基质成分和抗压强度。结论aBMSC-dECM支架有利于维持细胞活性和生物学功能,能促进组织工程软骨的形成,可成为一种具有较高应用价值的组织工程软骨支架材料。第三部分aBMSC-dECM支架对自体骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用目的探讨aBMSC-dECM支架对自体骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用。方法分离、培养2周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,原代培养4周后收集其分泌的aBMSC-dECM膜,采用交联和冻干技术制备三维多孔状支架。将自体骨髓间充质干细胞植入aBMSC-dECM支架,细胞-支架复合物分别行体外和裸鼠皮下种植培养,对照组使用atelocollagen支架。体外培养随机分成四组：①C+组：BMSCs/atelocollagen支架复合物置于含有成软骨分化诱导因子TGF-β3的培养体系；②E+组：BMSCs/aBMSC-dECM支架复合物置于含有TGF-β3的培养体系；③C-组：BMSCs/atelocollagen支架复合物置于不含有TGF-β3的培养体系；④E-组：BMSCs/aBMSC-dECM支架复合物置于不含有TGF-β3的培养体系；分别于体外培养3d、10d和21d对各组再生组织行组织学分析、Real-Time PCR和生化成分分析。裸鼠皮下种植前,先将aBMSC-dECM支架组和atelocollagen支架组细胞-支架复合物置于不含有TGF-β3的培养体系体外培养1w；分别于体内植入后1w、2w和3w对再生组织行大体观察、体积测量、生软骨分化检测和成骨分化检测。结果体外培养过程中,与C+组和C-组相比,E+和E-组再生组织中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达逐渐增多,COL2A1、ACAN及SOX9基因表达量持续升高,再生组织的总DNA含量维持在一个较高水平,GAG含量和GAG/DNA比值持续升高。体内培养初期,aBMSC-dECM支架组再生组织中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达呈强阳性,但随时间延长表达逐渐减弱,成骨分化逐渐增强；而atelocollagen支架组在体外培养过程中再生组织体积逐渐缩小,基质中未见蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达,至后期组织大部分区域被新生骨组织替代结论aBMSC-dECM支架可促进和维持自体骨髓间充质干细胞成软骨分化,有利于组织工程软骨形成。第四部分aBMSC-dECM支架结合骨髓刺激术修复关节软骨缺损的实验研究目的探讨结合aBMSC-dECM支架植入,对骨髓刺激术(BMS)修复关节软骨缺损的作用。方法选取健康成年新西兰大白兔24只,分离、培养骨髓间充质干细胞,原代培养4w后收集其分泌的aBMSC-dECM膜,采用交联和冻干技术制备三维多孔状支架。于双侧膝关节股骨滑车部位制作全层软骨缺损模型,右侧膝关节(BMS组)行骨髓刺激术修复软骨缺损,左侧膝关节(BMS+Scaffold组)在完成骨髓刺激术后,在缺损处植入aBMSC-dECM支架。分别于术后6w,12w对两组再生软骨行大体观察、组织学检查及评分、生化成分分析。结果术后12w,与BMS组相比,BMS+Scaffold组再生软骨覆盖更完整,与周边正常软骨整合较好；BMS+Scaffold组再生软骨基质中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原含量和分布接近正常软骨,以圆形、椭圆形透明软骨样细胞为主,纤维走行垂直于关节面,ICRS评分显著高于BMS组；BMS+Scaffold组再生软骨基质中DNA及GAG含量接近正常软骨。结论结合aBMSC-dECM支架植入可有效提高骨髓刺激术修复软骨缺损疗效,具有较高的临床应用价值。
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全文目录
英文缩略词对照表 5-6
中文摘要 6-10
英文摘要 10-15
前言 15-20
参考文献 17-20
第一部分 aBMSC-dECM支架的制作及其性能研究 20-35
前言 20
材料与方法 20-27
结果 27-29
讨论 29-31
结论 31
参考文献 31-35
第二部分 aBMSC-dECM支架在软骨再生中的应用 35-59
前言 35
材料与方法 35-47
结果 47-53
讨论 53-55
结论 55
参考文献 55-59
第三部分 aBMSC-dECM支架对自体骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用 59-80
前言 59
材料与方法 59-68
结果 68-70
讨论 70-76
结论 76
参考文献 76-80
第四部分 aBMSC-dECM支架结合骨髓刺激术修复关节软骨缺损的实验研究 80-98
前言 80
材料与方法 80-87
结果 87-91
讨论 91-94
结论 94
参考文献 94-98
综述 98-114
参考文献 105-114
攻读学位期间成果 114-116
致谢 116-117
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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