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具有不同孔径的三维多孔支架材料的制备以及孔径对细胞体外生长和分化调节作用的研究

作 者: 谭可
导 师: 叶朝阳
学 校: 华东理工大学
专 业: 生物化工
关键词: 组织工程 三维多孔支架 孔径 细胞行为
分类号: R318.08
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 16次
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内容摘要


组织工程概念的提出为修复重建病损组织或器官带来了希望,其基本原理是基于细胞、材料以及生物因子的有机结合,构建出具有与天然组织结构和功能类似的组织器官替代物。细胞在体内处于特定的微环境之中,受到严格的调控;而生物材料则需要通过模拟细胞的体内微环境,来精确调控细胞行为,才可能最终促进组织结构的形成。近年来的研究发现,生物材料的物理结构及力学特性都是决定体外细胞行为的关键因素。孔径作为多孔生物支架材料的关键参数,对于组织结构的形成有着决定性的影响。但是,目前的认识还不具系统性,依然有待深入研究。为此,本论文基于生物相容性好且可降解的聚己内酯(Polycaprolactone, PCL)材料,制备了具有不同孔径(100-200μm,200-300μm,300-450μm和450-600μm)的三维多孔支架;考察了支架孔径的变化对一系列组织工程种子细胞生物学行为的影响,包括对人羊膜来源的间充质干细胞(human aminotic membrane-derived mesenchymal stem cells, hAMSCs)的粘附、增殖及分化的调节作用,对兔关节软骨细胞(rabbit articular chondrocytes, rACs)表型维持和分化的影响,以及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical endothelial cells, HUVEC)与hAMSCs共培养条件下]hAMSCs成骨分化能力的影响作用。通过以上实验研究,我们发现:①结合溶剂浇注/粒子浸出和热致相分离技术能成功制备四种不同孔径的三维多孔支架,且支架的连通性良好,孔隙率均在95%以上;②hAMSCs和rACs在三维多孔支架上均能很好的粘附和增殖,但是hAMSCs增殖会随着孔径的增加而不断降低,同时hAMSCs往支架中迁移的深度随着孔径的增加而增加;③在成骨诱导培养条件下,孔径较小(100-300μm)的支架更有利于hAMSCs的成骨分化,而过大的孔径不利于hAMSCs的成骨分化;④在成软骨诱导培养条件下,孔径为200-450μm的支架更有利于hAMSCs和P3rACs的成软骨分化,而孔径过大或过小都不利于细胞的成软骨分化,相反,稍大的孔径对P1rACs软骨表型的维持比较有利;⑤hAMSCs和HUVEC以hAMSCs:HUVEC=3:1的数量比在混合培养基中直接混合共培养更利于hAMSCs的成骨分化和血管化。因此,基于本研究工作,三维多孔支架的孔径对1hAMSCs的粘附、增殖和分化以及rACs的表型都有显著影响,这揭示了支架微结构对细胞生物学行为的调控规律,对指导组织构建具有重要的意义。但是,对于孔径调节细胞行为的机制还有待深入研究,同时HUVEC是如何促进hAMSCs成骨诱导分化的,也需要进一步的考察。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-11
第1章 绪论  11-22
  1.1 组织工程概念  11-12
  1.2 种子细胞  12-13
    1.2.1 成熟体细胞  12-13
    1.2.2 间充质干细胞  13
  1.3 生物支架材料  13-16
  1.4 生物材料与细胞间相互作用的研究进展  16-20
    1.4.1 干细胞壁龛的概念  16-17
    1.4.2 生物材料化学性质对细胞行为的影响  17
    1.4.3 生物材料力学性质对细胞行为的影响  17-18
    1.4.4 生物材料物理结构对细胞行为的影响  18-19
    1.4.5 生物材料物理特性调节细胞行为的机制研究  19-20
  1.5 本课题的提出  20-22
第2章 三维多孔支架的制作及表征  22-30
  2.1 概述  22
  2.2 实验材料与方法  22-24
    2.2.1 明胶微球的制备  22-23
    2.2.2 三维多孔支架的制备  23
    2.2.3 制备FITC-gelatin标记的三维多孔支架  23
    2.2.4 扫描电镜观察  23-24
    2.2.5 支架孔隙率的测定  24
    2.2.6 支架连通性的测定  24
  2.3 结果与讨论  24-28
    2.3.1 明胶微球形态和三维多孔支架微观结构  24-26
    2.3.2 三维多孔支架孔径大小及其分布  26-27
    2.3.3 FITC-gelatin标记的三维多孔支架  27
    2.3.4 支架的孔隙率  27-28
    2.3.5 支架的连通性表征  28
  2.4 本章小结  28-30
第3章 三维多孔支架孔径对hAMSCs粘附、增殖以及分化的影响  30-53
  3.1 概述  30
  3.2 材料与方法  30-36
    3.2.1 羊膜组织来源  30
    3.2.2 hAMSCs的分离与培养  30-31
    3.2.3 细胞冻存  31
    3.2.4 细胞复苏  31
    3.2.5 三维多孔支架的预处理  31
    3.2.6 细胞接种  31-32
    3.2.7 CCK-8检测  32
    3.2.8 细胞骨架和细胞核染色  32
    3.2.9 细胞死活染色  32
    3.2.10 蛋白浓度的测定  32-33
    3.2.11 细胞免疫荧光染色  33
    3.2.12 SEM观察  33
    3.2.13 茜素红染色  33
    3.2.14 Ca含量的测定  33
    3.2.15 NBT染色  33-34
    3.2.16 ALP活性测定  34
    3.2.17 番红-O染色  34
    3.2.18 阿利新蓝染色  34
    3.2.19 Ⅱ型胶原免疫荧光染色  34
    3.2.20 DNA和GAG测定  34-35
    3.2.21 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)  35-36
    3.2.22 统计学分析  36
  3.3 结果与讨论  36-52
    3.3.1 hAMSCs在不同孔径的三维多孔支架上的粘附  36-37
    3.3.2 三维多孔支架孔径对hAMSCs活性和迁移的影响  37-41
    3.3.3 三维多孔支架孔径对hAMSCs粘附蛋白表达的影响  41-43
    3.3.4 三维多孔支架孔径对hAMSCs成骨诱导增殖的影响  43-44
    3.3.5 三维多孔支架孔径对hAMSCs成骨诱导分化能力的影响  44-48
    3.3.6 三维多孔支架孔径对hAMSCs成软骨诱导分化能力的影响  48-52
  3.4 本章小结  52-53
第4章 三维多孔支架孔径对软骨细胞去分化和再分化行为的影响  53-61
  4.1 概述  53-54
  4.2 材料与方法  54-55
    4.2.1 rACs的分离与冻存  54
    4.2.2 细胞的复苏  54
    4.2.3 三维多孔支架的预处理  54
    4.2.4 接种  54
    4.2.5 CCK-8检测  54
    4.2.6 番红-O染色  54
    4.2.7 阿利新蓝染色  54-55
    4.2.8 DNA和GAG测定  55
    4.2.9 统计学分析  55
  4.3 结果与讨论  55-60
    4.3.1 三维多孔支架孔径对P_1 rACs增殖的影响  55
    4.3.2 三维多孔支架的孔径对P_1 rACs去分化的影响  55-58
    4.3.3 三维多孔支架的孔径对P_3 rACs再分化的影响  58-60
  4.4 本章小结  60-61
第5章 三维多孔支架中共培养hAMSCs和HUVEC的成骨分化  61-71
  5.1 概述  61-62
  5.2 材料与方法  62-63
    5.2.1 细胞分离与培养  62
    5.2.2 细胞冻存  62
    5.2.3 细胞复苏  62
    5.2.4 三维多孔支架的预处理  62
    5.2.5 细胞接种  62-63
    5.2.6 CCK-8检测  63
    5.2.7 茜素红染色  63
    5.2.8 NBT染色  63
    5.2.9 CD31免疫荧光染色  63
    5.2.10 Ca含量的测定  63
    5.2.11 统计学分析  63
  5.3 结果与讨论  63-69
    5.3.1 不同培养条件下hAMSC_s与HUVEC在三维多孔支架上的增殖和成骨分化效果  63-67
    5.3.2 HUVEC细胞数量对hAMSC_s在三维多孔支架上成骨分化的影响  67-69
  5.4 本章小结  69-71
第6章 全文总结与展望  71-73
参考文献  73-82
致谢  82-83
攻读硕士学位期间的发表文章  83

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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