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USP18对干扰素α和干扰素λ抗病毒信号通路的影响及意义

作　者: 朱战涛
导　师: 周俊英
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 泛素特异性蛋白酶18 干扰素-α 干扰素-λ JAK-STAT 双链RNA依赖的蛋白激酶R 抗黏病毒蛋白A
分类号: R978.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：干扰素（interferon，IFN）是目前慢性乙型病毒性肝炎（ChronicHepatitis B，CHB）和慢性丙型病毒性肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）抗病毒治疗过程中一个重要的组成部分。在抗乙型肝炎病毒药物中，IFN与核苷（酸）类似物相比具有疗程短、停换药方便等优势；在慢性丙型病毒肝炎治疗中，IFN联合利巴韦林还是其标准治疗方案。虽然目前已有数十种干扰素被发现，然而在中国仅有隶属于Ⅰ型干扰素的IFN-α应用到病毒性肝炎的抗病毒治疗中。但是，在此治疗过程中仅有30%-40%CHB患者能达到e抗原的血清学转换，约有60%的患者对其治疗应答不佳；而且有50%-60%的基因1型CHC患者无法得到持续病毒学应答（SustainedVirological Response，SVR）。与此同时，由于IFN-α的诸多副作用，部分患者在治疗过程中还因为严重的副反应而终止治疗。近期研究发现泛素特异性蛋白酶18（Ubiquitin-specific protease18，USP18）是IFN-α疗效的重要影响因子，并且进一步研究证实USP18是IFN-α治疗效果的重要负性调节因子。IFN-λ是最新发现的一类新型干扰素，隶属于Ⅲ型干扰素；与IFN-α类似它也是通过激活JAK-STAT（Janus activated kinase-signal transducerand activator of transcription，JAK-STAT）通路并调控一系列抗病毒蛋白如：双链RNA依赖的蛋白激酶R（PKR)和抗黏病毒蛋白（mixovirus resistanceprotein A，MxA）来发挥抗病毒作用。最新体外研究发现在IFN-α应答不佳的细胞中IFN-λ仍然可以发挥抗病毒作用。关于USP18在IFN-α的抗病毒通路中的研究进展很多，但对于其在IFN-λ的抗病毒信号转导通路中的影响报道甚少。本研究旨在探讨USP18对IFN-α和IFN-λ抗病毒信号通路的不同影响及其临床意义。方法：复苏Huh-7细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM培养基在5%CO2，37℃条件下培养至对数生长期，然后分为空白对照组、IFN-α实验组和IFN-λ实验组。1IFN-α实验组给予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ实验组给予IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激，空白对照组常规培养并加入等体积无菌生理盐水，分别于6h，12h，24h，48h后收细胞。2空白对照组常规培养并加入无菌生理盐水，IFN-α实验组给予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ实验组给予IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激12小时，然后三组细胞用预冷的PBS缓冲液漂洗三遍后重新置入新鲜的无干扰素培养基中培养16h，然后分别再次给予无菌生理盐水、IFN-α2a（20IU/ml）和IFN-λ1（10ng/ml）刺激12h后收细胞。3空白对照组常规培养并加入无菌生理盐水，IFN-α实验组给予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ实验组给予IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激12小时，然后三组细胞用预冷的PBS缓冲液漂洗三遍后重新置入新鲜的无干扰素培养基中培养16h，然后再分别给予无菌生理盐水、IFN-λ1（10ng/ml）和IFN-α2a（20IU/ml）刺激12h后收细胞。实时荧光定量聚合酶连反应（Real Time-quantitative Polymerase ChainReaction, RT-qPCR）法检测Huh-7细胞USP18、STAT1、PKR和MxA的mRNA表达水平。Western-blot检测USP18、P-STAT1、STAT1、PKR及MxA的蛋白表达水平。结果：1不同干扰素刺激时间（6h，12h，24h，48h）各组Huh-7细胞指标的变化：1.1各组细胞USP18的表达变化：随着干扰素刺激时间的延长，IFN-α实验组和IFN-λ实验组Huh-7细胞内USP18mRNA的表达增加，但IFN-α组比IFN-λ组增加更为明显且在24h、48h USP18mRNA的表达明显高于IFN-λ组（5.33±0.47VS4.60±0.42，5.41±0.46VS4.76±0.78），差异有统计学意义（P<0.01）。此外，IFN-α组和IFN-λ组细胞的USP18mRNA均高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。随着干扰素刺激时间的延长，IFN-α组和IFN-λ组Huh-7细胞内USP18蛋白的表达也开始增加，IFN-α组比IFN-λ组增加更明显且在48h时USP18蛋白的升高明显大于IFN-λ组（1.61±0.04VS1.46±0.03），差异有统计学意义（P<0.05）。1.2不同刺激时间各组细胞STAT1、PKR和MxA的表达变化以及STAT1磷酸化蛋白的变化：1.2.1随着干扰素刺激时间的延长，IFN-α组和IFN-λ组Huh-7细胞内STAT1、PKR和MxA mRNA表达呈现上升趋势，并且在刺激12h时IFN-α组STAT1、PKR和MxA mRNA表达水平达到最高，且明显高于IFN-λ组（5.61±0.44VS4.84±0.33，5.42±0.37VS4.68±0.15，3.82±0.35VS3.23±0.46），差异有统计学意义（P值均<0.01）。随后，IFN-α组的STAT1、PKR和MxA mRNA表达水平呈现降低趋势，而IFN-λ组的表达继续上升并在24h时达到高峰，并且高于IFN-α组（5.30±0.15VS5.95±0.37，4.81±0.43VS5.81±0.40，3.37±0.46VS4.63±0.62），差异有统计学意义（P值均<0.01）。此后两组的STAT1、PKR和MxA mRNA表达开始下降，但48h IFN-λ组仍高于IFN-α组。各组Huh-7细胞STAT1、PKR和MxA蛋白水平变化与mRNA表达变化类似。1.2.2随着干扰素刺激时间的延长，IFN-α组和IFN-λ组Huh-7细胞内STAT1磷酸化蛋白的表达呈现上升趋势。IFN-α组的STAT1磷酸化蛋白表达水平高于IFN-λ组，并且在刺激12h时IFN-α组STAT1磷酸化蛋白表达水平达到最高，且明显高于IFN-λ组（1.19±0.02VS0.63±0.02），差异有统计学意义（P<0.05）。随后，IFN-α组STAT1磷酸化蛋白表达开始下降，IFN-λ组的表达继续上升并在24h时达到高峰，并且高于IFN-α组（0.71±0.01VS1.25±0.02），差异有统计学意义（P<0.05）。2三组细胞分别给予无菌生理盐水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激12h后更换无干扰素的新鲜培养基培养16h后再次给予无菌生理盐水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1（10ng/ml）刺激12h后细胞各个指标的变化。2.1各指标mRNA表达的变化：IFN-α组的USP18mRNA表达高于IFN-λ组（4.04±0.39VS3.25±0.26），差异有统计学意义（P<0.05）。IFN-α组STAT1、PKR、MxA的mRNA表达均低于IFN-λ组（4.71±0.28VS6.54±0.26，3.71±0.25VS5.41±0.32，2.91±0.23VS4.31±0.19），差异有统计学意义（P值均<0.05）。2.2各指标蛋白表达水平的变化：IFN-α组的USP18蛋白表达高于IFN-λ组（1.93±0.15VS1.82±0.14），差异有统计学意义（P<0.05）。IFN-α组STAT1、P-STAT1、PKR、MxA的蛋白表达均低于IFN-λ组分别为（1.13±0.16VS1.61±0.17，1.12±0.18VS1.49±0.15，1.31±0.13VS1.91±0.16，1.09±0.19VS1.59±0.10），差异有统计学意义（P值均<0.05）。3三组细胞分别给予无菌生理盐水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激12h后更换无干扰素的新鲜培养基培养16h后再给予无菌生理盐水、IFN-λ1（10ng/ml）、IFN-α2a（20IU/ml）刺激12h后细胞各个指标的变化。3.1各指标mRNA表达的变化：IFN-α组的USP18mRNA表达与IFN-λ组（3.54±0.28VS3.46±0.31）相比差异无统计学意义（P>0.05）。IFN-α组STAT1、PKR和MxA的mRNA表达低于IFN-λ组（5.69±0.22VS5.81±0.33，4.31±0.20VS4.76±0.26，3.49±0.27VS3.80±0.20），差异有统计学意义（P值均<0.05）。3.2各指标蛋白表达水平的变化：IFN-α组USP18蛋白表达低于IFN-λ组（1.76±0.16VS1.90±0.12），差异有统计学意义（P<0.05）。两组细胞P-STAT1表达无差异（1.29±0.15VS1.30±0.19，P>0.05）。IFN-α组PKR、MxA蛋白表达低于IFN-λ组（1.40±0.10VS1.49±0.14，1.23±0.11VS1.42±0.14），差异有统计学意义（P值均<0.05）。结论：1在Huh-7细胞内IFN-λ的抗病毒信号转导不受USP18的影响。2在对IFN-α刺激不敏感的Hun-7细胞中IFN-λ仍能激活抗病毒信号通路，促进抗病毒蛋白的生成。3IFN-α刺激Huh-7细胞后抗病毒蛋白生成迅速，但消退速度也快；而IFN-λ刺激后抗病毒蛋白的生成相对缓慢，但持续的时间更加的持久。4重复使用IFN-α刺激Huh-7细胞后USP18水平明显升高，抗病毒蛋白生成减少。5重复使用IFN-λ刺激Huh-7细胞USP18的升高不明显，抗病毒蛋白生成未见减少。

USP18对干扰素α和干扰素λ抗病毒信号通路的影响及意义

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