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雌激素延缓皮肤老化作用机制的初步探讨

作 者: 左俊
导 师: 李勤
学 校: 南方医科大学
专 业: 外科学
关键词: 雌激素(二醇) ICI-182780 SB203580 PD98059 SP600125 成纤维细胞 苯甲酸雌二醇 皮肤老化 超氧化物歧化酶(SOD) 羟脯氨酸(HYP) 丙二醛(MDA)
分类号: R96
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


第一部分雌二醇对皮肤成纤维细胞增殖迁移影响及其调控机制的实验研究目的:观察雌激素(17β-estrogen,17β-E2)对体外培养的正常人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblast,HSFB)增殖与迁移的影响,探究雌激素调控人皮肤成纤维细胞增殖是否受到丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)的影响,弄清其可能的调控途径及机制。方法:采用酶消化法体外分离培养正常人皮肤成纤维细胞,取第3-6代细胞用于实验;1.采用MTT法,分别于不同浓度17β-E2、17β-E2+雌激素p受体拮抗剂ICI-182780和空白干预后24、48、72、96h,检测成纤维细胞的分裂增殖活力;2.建立体外细胞划痕(Scratch-Wound)模型,分别于模型制备后24、48h、72h利用倒置相差显微镜观察细胞在不同浓度17β-E2、17β-E2+ICI-182780和空白干预下的迁移情况;3.利用免疫细胞化学技术检测成纤维细胞爬片在17β-E2、17β-E2+ICI-182780和空白干预后TGFβ1蛋白表达的变化;4.流式细胞术检测17β-E2及雌激素p受体拮抗剂ICI-182780对成纤维细胞周期分布的影响;5.按干预因素的不同将细胞分为6组:空白对照组(A组)、17β-E2组(B组)、17β-E2+ICI-182780组(C组)、17β-E2+PD98059组(D组)、17β-E2+SP600125组(E组)和17β-E2+SB203580组(F组),收集经上述各激酶抑制剂和(或)雌激素处理后的成纤维细胞,提取总RNA和总蛋白,分别利用荧光定量PCR和Western-Blot技术检测各组细胞增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen, PCNA) mRNA和蛋白的表达变化情况。结果:1.(1)MTT检测发现,24h时,各个浓度(10-8-10-12mol/L)雌激素刺激组细胞增殖效应与空白对照组无显著差异(0.118±0.005、0.113±0.007、0.128±0.013、0.113±0.006、0.122±0.012vs0.115±0.007)(P>0.05);48、72、96h时,均以10-10mol/l雌激素组促增殖效应最强(48h,0.208±0.015vs0.121±0.015、0.137±0.017、0.172±0.012、0.137±0.019);其中72、96h时各浓度组雌激素促增殖效应均显著强于空白组(72h,0.245±0.028、0.303±0.022、0.378±0.041、0.276±0.036、0.232±0.022vs0.166±0.025;96h,0.344±0.036、0.406±0.033、0.485±0.031、0.386±0.032、0.368±0.034vs0.196±0.033)(P<0.01);(2)24h时,IC1-182780+10-10mol/l雌激素组(B组)与空白对照(C组)、10-10mol/l雌激素组(A组)细胞增殖效应无统计学差异(0.120±0.015vs0.113±0.007、0.128±0.015)(P>0.05);而48、72、96h时,A组促增殖效应均明显强于另外两组(48h,0.211±0.015vs0.119±0.016、0.136±0.015;72h,0.352±0.049vs0.168±0.030、0.232±0.025;0.486±0.028vs0.196±0.024、0.368±0.034)(P<0.01);B组细胞在48h时增殖效应与C组无差别(0.136±0.015vs0.119±0.016)(P>0.05),但72、96h时均显著强于C组(72h,0.232±0.025vs0.168±0.030;96h,0.368±0.034vs0.196±0.024)(P <0.01)。2.(1)比较48h时各组细胞迁移效应,以10-8mol/l雌激素组最强(568.44±11.305vs413.2±25.616、429.4±20.281、507.8±17.312、568.4±11.305、484.1±13.675、452.6±14.741)(P <0.01),10-7mol/l、10-9mol/l及10-10mol/l组也有较强促迁移效应(507.8±17.312、484.1±13.675、452.6±14.741vs413.2±25.616)(P<0.01);但10-6mol/l组对细胞迁移无明显影响(429.4±20.281vs413.2±25.616)(P>0.05);(2)24h、48h、72h时,10-8mol/l雌激素组(A组)细胞迁移距离与ICl-182780+10-8mol/l雌激素组(B组)及空白对照组(C组)相比具有显著差异(24h,375.0±13.784vs225.6±10.761、243.0±14.747;72h,567.0±10.247vs407.6±11.718、416.6±16.134;96h,735.4±10.854vs603.8±18.887、623.2±15.057)(P<0.01),而B、C组之间无统计学差异(P>0.05);3.细胞爬片中以雌激素刺激组TGFβ1蛋白表达最高(155.4±22.941vs103.2±10.281、87.4±9.343)(P<0.01),其余两组无显著差异(P>0.05);4.A组中处于S期的细胞比例明显多于B、C二组(58.20±1.387%vs13.02±1.052%、9.50±1.483%)(P<0.01), G0/G1期的细胞比例则显著少于B、C二组(3.66±0.321%vs50.18±2.685%、62.36±2.474%)(P<0.01),其G2/M期的比例与B组无差别(38.14±1.652%vs36.82±3.505%)(P>0.05),但多于C组(38.14±1.652%vs28.14±2.661%)(P<0.01); B、C二组各期细胞比例均存在显著差异(P<0.01);5.B组的PCNA mRNA表达水平较A组显著升高(4.360±1.086vs1.000±0.000)(P<0.01),但C、D组与B组相比PCNA mRNA表达水平被显著抑制(2.012±0.357、2.097±0.353vs4.360±1.086)(P<0.05),而E、F组与B组相比无统计学差异(4.313±0.962、4.319±0.975vs4.360±1.086)(P>0.05);6.各组PCNA蛋白表达变化基本与其mRNA表达水平相一致。结论:1.雌激素对真皮成纤维细胞有强促有丝分裂作用,促进细胞增殖,在(10-8、10-9、10-10、10-11、10-12mol/L)浓度范围内,以10-10mol/L浓度组效应最强;2.有强趋化作用,促进细胞迁移,在(10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)浓度范围内,以10-8mol/L浓度组最强;3.而雌激素β受体阻断剂ICI-182780能有效减弱雌激素的上述两种效应;4.雌激素能促进成纤维细胞分泌TGFβ1蛋白;5.雌激素β受体(Estrogen Recepter β,ERβ)及ERK/MAPK信号通路参与雌激素调控的成纤维细胞增殖过程。第二部分雌激素延缓大鼠皮肤老化作用机制的实验研究目的:观察苯甲酸雌二醇对去卵巢大鼠皮肤中相关因素的影响,探讨雌激素抗皮肤老化作用机制。方法:将40只Wistar雌性大鼠随机分成四组:空白组(A组)、假手术组(B组)、模型组(C组)和模型+苯甲酸雌二醇肌注组(D组),每组各10只。通过手术摘除双侧卵巢建立大鼠自然老化模型(C组和D组),A组不做任何处理,B组只摘取双侧卵巢周围少许脂肪组织;术后一周内连续行阴道细胞学涂片,验证造模是否成功;术后一周各组大鼠开始肌注给药(A、B、C三组生理盐水,D组苯甲酸雌二醇);给药八周后处死动物,取血检测各组大鼠血清中的雌二醇(E2)浓度,并剪取各组大鼠背部相同部位皮肤制成组织匀浆后检测超氧化物歧化酶(SOD)活性、羟脯氨酸(HYP)含量及丙二醛(MDA)含量。结果:与A组相比,C组血清E2水平(pg/ml)(38.51±3.58vs49.31±3.52)及HYP含量(mg/g湿重)(3.26±0.259vs4.57±0.355)均显著下降(P<0.01),进一步说明大鼠去卵巢皮肤自然老化模型成功建立;与C组相比,D组血清E2水平(pg/ml)(50.69±3.61vs38.51±3.58)(P<0.01)及HYP含量(mg/g湿重)(4.06±0.231vs3.26±0.259)(P<0.01)均显著增加;B组血清E2水平与A组相比(pg/ml)(46.43±4.86vs49.31±3.52)无显著性差异(P>0.05),但HYP含量显著减少(mg/g湿重)(4.20±0.172vs4.57±0.355)(P<0.01);与A组相比,C组皮肤SOD活性显著降低(U/g蛋白)(100.68±7.92vs130.01±6.49)(P<0.01), MDA含量明显增高(P<0.01);与C组相比,D组SOD活性显著增高(U/g蛋白)(116.38±7.84vs100.68±7.92)(P<0.01), MDA含量显著降低(mmol/g蛋白)(2.55±0.29vs1.61±0.22)(P<0.01);与A组相比,B组SOD活性(U/g蛋白)及MDA含量(mmol/g蛋白)均无显著差异(125.57±8.66vs130.01±6.49,1.56±0.26vs1.61±0.22)(P>0.05),但D组SOD活性显著降低(U/g蛋白)(116.38±7.84vs130.01±6.49)(P<0.01), MDA含量显著增高(2.06±0.24vs1.61±0.22)(P<0.01),因此苯甲酸雌二醇能提高去卵巢大鼠皮肤组织中SOD活性、HYP含量及血清中E2浓度,同时降低MDA含量。结论:苯甲酸雌二醇能通过增加大鼠皮肤组织中胶原纤维的表达,同时增强其抗氧化损伤能力来延缓去卵巢大鼠皮肤老化。

全文目录


摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
第一部分 雌二醇对皮肤成纤维细胞增殖迁移影响及其调控机制的研究  15-59
  前言  15-16
  材料与方法  16-32
  结果  32-48
  讨论  48-54
  结论  54
  参考文献  54-59
第二部分 雌激素延缓大鼠皮肤老化作用机制的实验研究  59-72
  前言  59
  材料与方法  59-63
  结果  63-68
  讨论  68-69
  结论  69-70
  参考文献  70-72
综述  72-83
  参考文献  79-83
攻读硕士学位期间的成果  83-84
致谢  84-85

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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