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不同浓度异烟肼对体外培养成骨细胞的毒性研究

作　者: 陈强
导　师: 叶哲伟
学　校: 华中科技大学
专　业: 外科学
关键词: 成骨细胞原代培养鉴定骨结核异烟肼毒性作用
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的成骨细胞的原代培养是成骨细胞体外实验的重要来源之一，现主要有酶消化法和组织块法2种，但这两种方法各有利弊。本实验拟探索一种高效、简便、可靠的体外培养新生SD大鼠原代成骨细胞的方法。方法新生清洁级SD乳鼠(出生24h内)15只，随机分为三组，每组5只，经乙醇浸泡消毒后取出颅骨，分别采用传统组织块培养法(A组)、优化组织块法(B组)和酶消化法(C组)进行处理，分离和培养成骨细胞。从细胞的形态学、生长特点、碱性磷酸酶(ALP)染色、ALP活性检测以及Ι型胶原免疫荧光染色等多方面对培养出的成骨细胞予以鉴定和比较。结果三种方法48h后均培养出成骨细胞，以骨块为中心分布，A组数量最少，C组最多。A、B两组细胞从第四天开始增长迅速，第七天达高峰，C组生长趋势低于前两组。ALP染色阳性可见浅棕色至棕黑色色素颗粒，A、B、C组成骨细胞阳性率依次为85%、92%、81%。ALP活性检测可见A、B组成骨细胞活性相似，且明显高于C组。3组I型胶原免疫荧光染色结果均呈阳性，A、B组细胞胞浆中I型胶原表达明显多于C组。结论优化后组织块法结合了传统组织块法和酶消化法的特点，可短期内培养出大量纯度高的成骨细胞，具有成骨细胞活性及成骨能力，可为骨替代材料或者骨组织工程的研究提供大量细胞。同时也为初学者提供了一种切实可行、操作简单的体外原代成骨细胞培养方法。目的目前我国结核病疫情十分严重，且合并感染骨结核者较多，治疗复杂，但效果欠佳。病灶清除术后联合局部抗结核治疗是现行值得考虑的方法之一。异烟肼(INH)作为抗结核的一线药物，对细胞内外结核菌都具有极强的杀菌效果，但对成骨细胞是否也具有毒性作用尚不明确。本实验拟研究不同浓度INH对新生SD大鼠原代成骨细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性和Ⅰ型胶原表达的影响，探讨异烟肼对体外培养成骨细胞的毒性作用，为骨结核病灶清除术后局部应用缓释微球提供理论依据。方法新生清洁级SD乳鼠(出生24h内)15只，采用优化组织块法体外分离培养原代成骨细胞并鉴定，鉴定方法同第一部分。取第3代成骨细胞，分别采用CCK-8法、碱性磷酸酶活性检测法和免疫荧光染色法测定，观察不同浓度（10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、100μg/ml）异烟肼对成骨细胞增值、ALP活性以及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。结果采用优化组织块法成功培养去原代成骨细胞，24h后逐渐游离出来，在48h细胞数增多明显，排列紧密，三种染色检测均阳性。给予不同浓度INH干预72h后，与对照组比较，异烟肼浓度在30μg/ml时，成骨细胞增长开始受到抑制，ALP活性开始减弱，Ⅰ型胶原合成开始减少。随着异烟肼浓度增高，这种抑制作用逐渐增强。当异烟肼浓度达60μg/ml时，细胞活性很弱，大部分细胞已经死亡。结论治疗骨结核时，要严格控制异烟肼剂量，INH局部药物浓度达到10μg/ml-20μg/ml范围时就可有效杀灭结核菌，且不影响成骨细胞的活性和Ⅰ型胶原蛋白的表达，不影响结核病灶清除术后的骨愈合，同时为异烟肼缓释体的研究提供了理论基础。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
前言  13-43
  第一部分优化组织块法体外培养新生SD大鼠原代成骨细胞与鉴定  15-28
    材料与方法  15-18
    结果  18-19
    讨论  19-21
    参考文献  21-23
    附图  23-28
  第二部分不同浓度异烟肼对体外培养成骨细胞的毒性作用  28-43
    材料与方法  28-32
    结果  32-34
    讨论  34-36
    参考文献  36-37
    附图表  37-43
附录攻读硕士期间发表论文情况  43-44
致谢  44

不同浓度异烟肼对体外培养成骨细胞的毒性研究

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