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重组水蛭素在大鼠体内的生物分析及其药代动力学研究

作 者: 姜素云
导 师: 徐永平
学 校: 大连理工大学
专 业: 生物化工
关键词: 重组水蛭素 药代动力学 分布 代谢产物 大鼠
分类号: R969.1
类 型: 博士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


随着基因工程技术的发展,重组多肽类药物已被广泛应用于临床医疗实践。这类药物的新药开发及临床合理应用必须首先阐明其药代动力学(Pharmacokinetics,PK)特点.。然而,多肽类药物PK研究一直是药物PK研究中的一大难点。本文针对这一难点问题进行了深入的研究。首先通过对凝血酶特异性抑制剂重组水蛭素(Recombinant Hirudin,rH)PK研究,建立多肽类药物PK研究的通用方法和适用于rH PK研究的个性方法;其次通过对rH在大鼠尿中代谢产物的分析建立多肽类药物在动物体内代谢产物研究的通用方法,同时研究rH在大鼠体内的代谢过程和代谢产物,为国产rH的研发和临床应用奠定基础。实验方法1、建立一种双抗体夹心酶联免疫吸附分析(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)技术,测定国产rH(N-Ile1-Thr-63-脱硫酸基-r-重组水蛭素)在大鼠血浆等生物样品中的浓度/含量,并全面研究静脉注射给药(intravenous injection,iv)rH后,rH在大鼠体内的PK和组织分布;2、根据rH具有抗凝血酶的生物特性,建立用生色底物法测定rH在大鼠血浆和尿中的浓度,并研究iv给予大鼠后,rH在大鼠血浆的PK及尿排泄:3、用125I标记rH得125I-rH,iv给予大鼠后,研究125I-rH在大鼠体内的PK,并同时研究rH在大鼠体内的代谢过程;4、将凝胶色谱和Y-计数仪相结合,通过测定血浆和尿中的放射性活性,研究rH在大鼠血浆中的代谢过程以及尿中的代谢产物,用凝胶色谱和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对尿中代谢产物进行分离纯化,采用飞行时间质谱以及氨基酸序列测定仪分析其代谢产物的分子量和结构序列。实验结果1.ELISA法能有效的测定大鼠体液和组织中rH的浓度/含量,最低检出量为0.25ng·mL-1,样品浓度在0.25ng·mL-1-3.0ng·mL-1之间线性关系良好(r=0.999)。其血药浓度用3p97程序软件拟合,均符合开放二室模型一级动力学过程。静脉注射rH剂量为0.5、1.0、2.0mg·kg-1时其各剂量主要动力学参数分别为:t1/2α(min):6.408±2.603,5.568±1.106,5.695±0.682; t1/2β(min):47.28±13.14,45.41±6.207,46.82±5.562;AUC(μg·mL-1×min):127.8±27.81,330.8±115.92,575.2±39.42.除AUC外,各浓度间的药代动力学参数均很接近,经统计处理无显著差异(P>0.05),其中t1/2α为5-6min,说明药物自中央室向外周室分布很快;t1,2β为45-47min,说明药物从血浆中消除也较快。三种剂量的AUC与剂量成正比(经回归计算r=0.991),说明在此范围内,药物在大鼠体内的消除为线性动力学。静脉注射给药1.0mg·kg-1,大鼠尿、粪便和胆汁中几乎检测不到原型的rH。组织分布实验表明,iv1.0mg·kg-1,呈快速分布,15分钟各组织中药物含量最高;以后逐渐减少。15分钟各组织分布以肺部含量最高为78.88±32.30ng·g-1,1h以肾脏含量最高,为24.39±39.7ng-g-1;3h以肝脏含量最高,仅为7.55±11.33ng·g-1.2.生色底物法能有效的测定大鼠血浆中rH的含量,rH的浓度在3.125-40ng·mL-1范围内呈线性关系(r=-0.995)。用该方法研究iv给药rH2.0mg·kg-1大鼠血浆药动学,除AUC外,其它药动学参数均与ELISA法一致;生色底物法能有效的测定大鼠尿中rH的含量,rH在6.25-75ng·mL-1浓度范围内呈线性关系(r=-0.997)。用该方法研究大鼠iv0.5、1.0和2.0mg·kg-1rH后尿药浓度及排泄动力学,0-12h的累积排泄率为分别给药量的22.30%、23.23%和23.29%,不随剂量改变而显著改变,表明rH在体内遵循一级线性动力学方式从尿中排泄。3、同位素示踪法研究125I-rH在大鼠体内的药动学结果显示,rH在大鼠体内的消除半衰期t1/2β(min)为701.9±198.0(RA)和724.9±81.2(TCA-RA);按总放射性活性计算,0-12h累计排泄率为给药量的62.1%,96h累计排泄率为给药量的90.8%。4、rH在血浆中被代谢,经由尿中排泄;其代谢产物具有抗凝血酶的生物活性,其中抗凝血酶活性最强的代谢产物的分子量为5162Da,由51-52个氨基酸组成。结论1、用ELISA法和生色底物法测定给药后大鼠生物样品中rH浓度/含量,经方法学验证表明灵敏度高、特异性强,符合多肽类药物药动学研究要求。用于rH的PK研究表明,国产rH在大鼠体内的PK行为符合开放二室模型一级动力学过程,其体内消除快速(半衰期在46min左右)。2、用同位素示踪法研究rH在大鼠体内的PK所得到的PK参数与所建立的ELISA以及生色底物法所得到的PK参数之间差异很大,很可能由于同位素示踪法缺乏选择性所致,提示这种方法不宜用于rH以及相关多肽PK研究。3、rH在大鼠体内经受广泛的代谢降解,尿中仅测得极微量原形rH,尿中排泄的部分代谢产物具有抗凝血酶活性;并首次发现并查明抗凝血酶活性最强的代谢产物的分子量为5162Da,由51/或52个氨基酸组成;首次发现血液是rH的主要代谢部位,而不是像国外文献报导那样在肝肾代谢。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
CONTENTS  12-15
图表目录  15-18
主要符号表  18-19
1 绪论  19-46
  1.1 背景意义  22-23
  1.2 水蛭素国内外研究进展  23-45
    1.2.1 水蛭素的结构特点  23
    1.2.2 水蛭素的化学稳定性  23-25
    1.2.3 水蛭素的提取和分离  25-26
    1.2.4 体内外分析方法的研究  26-29
    1.2.5 水蛭素的生物活性  29
    1.2.6 重组水蛭素的药效学研究  29-36
    1.2.7 临床研究及应用  36-42
    1.2.8 水蛭素的毒副作用  42-43
    1.2.9 药代动力学研究  43-45
  1.3 本论文主要研究内容与思路  45-46
2 应用ELISA法研究重组水蛭素在大鼠体内的药代动力学  46-60
  2.1 实验材料  47
    2.1.1 药品和试剂  47
    2.1.2 实验动物  47
    2.1.3 仪器设备  47
  2.2 实验方法  47-50
    2.2.1 ELISA法的基本原理  47
    2.2.2 ELISA法的操作步骤  47-48
    2.2.3 各种溶液的配制  48-49
    2.2.4 标准曲线的制备  49
    2.2.5 ELISA法方法学验证  49
    2.2.6 重组水蛭素大鼠血浆药动学的研究  49-50
    2.2.7 重组水蛭素在大鼠体内排泄的研究  50
    2.2.8 重组水蛭素在大鼠体内分布的研究  50
  2.3 实验结果  50-58
    2.3.1 ELISA法标准曲线的制备  50
    2.3.2 ELISA法精密度试验  50
    2.3.3 ELISA法的方法回收率  50-51
    2.3.4 ELISA法的稀释回收率  51-53
    2.3.5 重组水蛭素大鼠血浆药动学  53-55
    2.3.6 重组水蛭素在大鼠体内的排泄  55-56
    2.3.7 重组水蛭素在大鼠体内的分布  56-58
  2.4 讨论  58-59
  2.5 结论  59-60
3 生色底物法研究重组水蛭素大鼠血浆药动学与尿排泄  60-75
  3.1 实验材料  60-61
    3.1.1 药品和试剂  60
    3.1.2 实验动物  60
    3.1.3 仪器设备  60-61
  3.2 实验方法  61-63
    3.2.1 生色底物分析法的基本原理  61
    3.2.2 生色底物分析法的操作步骤  61
    3.2.3 各种溶液的制备  61
    3.2.4 血浆样品的预处理  61-62
    3.2.5 影响因素的考察  62
    3.2.6 血浆标准曲线的制备  62
    3.2.7 尿标准曲线的制备  62
    3.2.8 方法学验证  62-63
    3.2.9 重组水蛭素大鼠血浆药动学的研究  63
    3.2.10 重组水蛭素大鼠尿排泄的研究  63
  3.3 实验结果  63-72
    3.3.1 生色底物分析法的基本原理  63-65
    3.3.2 标准曲线范围及最低定量限  65-67
    3.3.3 精密度实验  67
    3.3.4 回收率实验  67-69
    3.3.5 静脉注射重组水蛭素大鼠血浆药动学  69-71
    3.3.6 静脉注射重组水蛭素大鼠尿排泄  71-72
  3.4 讨论  72-75
4 同位素示踪法研究重组水蛭素在大鼠血浆药动学与尿排泄  75-99
  4.1 水蛭素的标记与纯化  75-85
    4.1.1 实验材料  75-76
    4.1.2 实验方法  76-78
    4.1.3 实验结果  78-84
    4.1.4 小结  84-85
  4.2 同位素示踪法研究重组水蛭素大鼠血浆药动学与尿排泄  85-95
    4.2.1 实验材料  85
    4.2.2 实验方法  85-87
    4.2.3 实验结果  87-95
  4.3 讨论  95-99
5 重组水蛭素在大鼠尿中代谢产物的研究  99-121
  5.1 实验材料  99-100
  5.2 试验方法  100-102
    5.2.1 供试品溶液的制备  100
    5.2.2 血浆放射性活性分析  100
    5.2.3 尿液放射性活性分析  100-101
    5.2.4 大鼠尿中代谢产物的分析  101-102
  5.3 实验结果  102-120
    5.3.1 ~(125)I-重组水蛭素样品放射性活性分析  102-105
    5.3.2 大鼠静脉注射~(125)I-重组水蛭素后血浆放射性活性分析  105-109
    5.3.3 大鼠静脉注射~(125)I-重组水蛭素后尿放射性活性分析  109-111
    5.3.4 凝胶色谱初步分析尿中代谢物  111-113
    5.3.5 反相HPLC进一步分析尿中代谢物  113-115
    5.3.6 生色底物法测定尿中代谢物抗凝血酶活性  115-117
    5.3.7 大鼠尿中代谢物的分子量测定  117-118
    5.3.8 大鼠尿中代谢物氨基酸序列测定  118-120
  5.4 讨论  120-121
6 结论与展望  121-123
  6.1 结论  121
  6.2 展望  121-122
  创新点摘要  122-123
参考文献  123-132
附录A 代谢产物氨基酸序列图谱  132-137
攻读博士学位期间科研项目及科研成果  137-139
致谢  139-140
作者简介  140-141

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 临床药理学 > 药物代谢动力学
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