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铜绿假单胞菌代谢产物抗肿瘤活性研究

作 者: 吴燕杰
导 师: 杨树林
学 校: 南京理工大学
专 业: 生物化工
关键词: 铜绿假单胞菌 双鼠李糖脂 绿脓菌素 抗肿瘤活性 氧化应激 细胞凋亡
分类号: R96
类 型: 硕士论文
年 份: 2014年
下 载: 26次
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内容摘要


铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的革兰氏阴性菌,其次级代谢产物在环境、工业、医药等行业有良好的应用前景。如鼠李糖脂作为一种用途广泛的生物表面活性剂,兼具加快伤口愈合、防治藻类、抑制微生物生长等生物活性;绿脓菌素是一种小分子吩嗪类蓝色色素,具有较强的氧化还原活性,可扩散并渗透进入细胞膜,过量产生氧自由基导致细胞死亡。本研究对模拟空间环境条件诱变得到的高产鼠李糖脂突变菌株P. aeruginosa M14808进行发酵,分离、纯化其次级代谢产物并表征鼠李糖脂的化学结构,研究鼠李糖脂及绿脓菌素的抗肿瘤活性,并探讨其作用机制。主要研究结果如下:1.结构表征结果表明,从发酵液中分离、纯化得到的鼠李糖脂主要为双鼠李糖脂Rh2C10C10。该物质对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用明显,可增强衰老相关β-半乳糖苷酶活性。AO/EB染色、DNA ladder、caspase-3活性及p53、bax、bcl-2、casepase-3、 caspase-9、Fas基因表达水平的检测结果表明,双鼠李糖脂促使MCF-7细胞坏死。2.对种子液进行分离、纯化,得到绿脓菌素。绿脓菌素能够抑制人非小细胞肺癌细胞A549及人肝癌细胞HepG2的生长,且呈剂量依赖关系。AO/EB染色、DNA ladder及单细胞凝胶电泳检测提示绿脓菌素可诱导肿瘤细胞发生凋亡。进一步研究表明绿脓菌素能诱导A549和HepG2细胞内ROS水平升高,caspase-3活性增强,抗氧化物质含量随之改变。HepG2细胞内p53、caspase-9、bax及PIG3mRNA表达水平显著升高, bcl-2/bax比值降低。抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)预处理后,A549和HepG2细胞的生存能力显著增强,氧化应激相关指标及各基因表达水平均有所改善。实验结果表明:绿脓菌素诱导A549和HepG2细胞产生氧化应激,并进而引起HepG2细胞内p53基因和线粒体途径介导的细胞凋亡

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-12
1 绪论  12-20
  1.1 铜绿假单胞菌概况  12
  1.2 鼠李糖脂的研究现状  12-14
    1.2.1 鼠李糖脂的结构  12
    1.2.2 鼠李糖脂的性质  12-13
    1.2.3 鼠李糖脂的应用  13-14
  1.3 绿脓菌素的研究现状  14-15
    1.3.1 绿脓菌素的结构  14-15
    1.3.2 绿脓菌素的生物活性  15
  1.4 氧化应激细胞凋亡  15-19
    1.4.1 氧化应激的概念  15-16
    1.4.2 细胞凋亡的概念  16
    1.4.3 细胞凋亡与细胞坏死  16-17
    1.4.4 细胞凋亡的过程和机理  17
    1.4.5 细胞凋亡的形态变化  17-18
    1.4.6 氧化应激、细胞凋亡与肿瘤的治疗  18-19
  1.5 本论文的主要研究内容  19-20
2 双鼠李糖脂的制备、表征及抗肿瘤活性  20-38
  2.1 材料与仪器  20-22
    2.1.1 实验材料  20
    2.1.2 主要试剂与药品  20-21
    2.1.3 主要溶液配制  21
    2.1.4 主要实验仪器  21-22
  2.2 实验方法  22-28
    2.2.1 菌种保藏  22
    2.2.2 微生物发酵  22-23
    2.2.3 双鼠李糖脂的分离、纯化  23
    2.2.4 双鼠李糖脂结构表征  23
    2.2.5 双鼠李糖脂的临界胶束浓度测定  23
    2.2.6 细胞培养  23-24
    2.2.7 细胞染毒  24
    2.2.8 细胞活性检测  24
    2.2.9 衰老相关β-半乳糖苷酶检测  24-25
    2.2.10 AO/EB染色  25
    2.2.11 DNA ladder  25
    2.2.12 caspase-3检测  25-26
    2.2.13 mRNA表达水平检测  26-28
    2.2.14 蛋白含量测定  28
    2.2.15 数据处理  28
  2.3 实验结果  28-36
    2.3.1 结构表征结果  28-30
    2.3.2 双鼠李糖脂的临界胶束浓度  30-31
    2.3.3 双鼠李糖脂对MCF-7细胞增殖的抑制作用  31-32
    2.3.4 双鼠李糖脂对衰老相关β-半乳糖苷酶的影响  32
    2.3.5 AO/EB染色  32-33
    2.3.6 DNA ladder  33
    2.3.7 双鼠李糖脂对caspase-3的影响  33
    2.3.8 双鼠李糖脂对基因表达水平的影响  33-36
  2.4 讨论  36-38
3 绿脓菌素的分离、纯化及抗肿瘤活性  38-57
  3.1 材料与仪器  38-39
    3.1.1 实验材料  38
    3.1.2 主要试剂与药品  38
    3.1.3 主要溶液配制  38-39
    3.1.4 主要实验仪器  39
  3.2 实验方法  39-44
    3.2.1 绿脓菌素的分离纯化  39-40
    3.2.2 细胞培养  40
    3.2.3 细胞染毒  40
    3.2.4 细胞活性检测  40
    3.2.5 衰老相关β-半乳糖苷酶检测  40-41
    3.2.6 细胞凋亡检测  41
    3.2.7 活性氧检测  41-42
    3.2.8 细胞抗氧化水平检测  42-44
    3.2.9 caspase-3检测  44
    3.2.10 mRNA表达水平检测  44
    3.2.11 蛋白测定  44
    3.2.12 数据处理  44
  3.3 实验结果  44-54
    3.3.1 绿脓菌素对肿瘤细胞存活率的影响  44-45
    3.3.2 绿脓菌素对肿瘤细胞β-半乳糖苷酶的影响  45-46
    3.3.3 AO/EB染色  46-47
    3.3.4 细胞DNA损伤  47-49
    3.3.5 绿脓菌素对肿瘤细胞内活性氧产生的影响  49
    3.3.6 绿脓菌素对肿瘤细胞抗氧化水平的影响  49-51
    3.3.7 绿脓菌素对caspase-3的影响  51
    3.3.8 绿脓菌素对基因表达水平的影响  51-54
  3.4 讨论  54-57
4 结论  57-58
  4.1 结论  57
  4.2 创新点  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-68
附录  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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