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铜绿假单胞菌代谢产物抗肿瘤活性研究
作 者: 吴燕杰
导 师: 杨树林
学 校: 南京理工大学
专 业: 生物化工
关键词: 铜绿假单胞菌 双鼠李糖脂 绿脓菌素 抗肿瘤活性 氧化应激 细胞凋亡
分类号: R96
类 型: 硕士论文
年 份: 2014年
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内容摘要
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的革兰氏阴性菌,其次级代谢产物在环境、工业、医药等行业有良好的应用前景。如鼠李糖脂作为一种用途广泛的生物表面活性剂,兼具加快伤口愈合、防治藻类、抑制微生物生长等生物活性;绿脓菌素是一种小分子吩嗪类蓝色色素,具有较强的氧化还原活性,可扩散并渗透进入细胞膜,过量产生氧自由基导致细胞死亡。本研究对模拟空间环境条件诱变得到的高产鼠李糖脂突变菌株P. aeruginosa M14808进行发酵,分离、纯化其次级代谢产物并表征鼠李糖脂的化学结构,研究鼠李糖脂及绿脓菌素的抗肿瘤活性,并探讨其作用机制。主要研究结果如下:1.结构表征结果表明,从发酵液中分离、纯化得到的鼠李糖脂主要为双鼠李糖脂Rh2C10C10。该物质对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用明显,可增强衰老相关β-半乳糖苷酶活性。AO/EB染色、DNA ladder、caspase-3活性及p53、bax、bcl-2、casepase-3、 caspase-9、Fas基因表达水平的检测结果表明,双鼠李糖脂促使MCF-7细胞坏死。2.对种子液进行分离、纯化,得到绿脓菌素。绿脓菌素能够抑制人非小细胞肺癌细胞A549及人肝癌细胞HepG2的生长,且呈剂量依赖关系。AO/EB染色、DNA ladder及单细胞凝胶电泳检测提示绿脓菌素可诱导肿瘤细胞发生凋亡。进一步研究表明绿脓菌素能诱导A549和HepG2细胞内ROS水平升高,caspase-3活性增强,抗氧化物质含量随之改变。HepG2细胞内p53、caspase-9、bax及PIG3mRNA表达水平显著升高, bcl-2/bax比值降低。抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)预处理后,A549和HepG2细胞的生存能力显著增强,氧化应激相关指标及各基因表达水平均有所改善。实验结果表明:绿脓菌素诱导A549和HepG2细胞产生氧化应激,并进而引起HepG2细胞内p53基因和线粒体途径介导的细胞凋亡。
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全文目录
摘要 5-6 Abstract 6-12 1 绪论 12-20 1.1 铜绿假单胞菌概况 12 1.2 鼠李糖脂的研究现状 12-14 1.2.1 鼠李糖脂的结构 12 1.2.2 鼠李糖脂的性质 12-13 1.2.3 鼠李糖脂的应用 13-14 1.3 绿脓菌素的研究现状 14-15 1.3.1 绿脓菌素的结构 14-15 1.3.2 绿脓菌素的生物活性 15 1.4 氧化应激与细胞凋亡 15-19 1.4.1 氧化应激的概念 15-16 1.4.2 细胞凋亡的概念 16 1.4.3 细胞凋亡与细胞坏死 16-17 1.4.4 细胞凋亡的过程和机理 17 1.4.5 细胞凋亡的形态变化 17-18 1.4.6 氧化应激、细胞凋亡与肿瘤的治疗 18-19 1.5 本论文的主要研究内容 19-20 2 双鼠李糖脂的制备、表征及抗肿瘤活性 20-38 2.1 材料与仪器 20-22 2.1.1 实验材料 20 2.1.2 主要试剂与药品 20-21 2.1.3 主要溶液配制 21 2.1.4 主要实验仪器 21-22 2.2 实验方法 22-28 2.2.1 菌种保藏 22 2.2.2 微生物发酵 22-23 2.2.3 双鼠李糖脂的分离、纯化 23 2.2.4 双鼠李糖脂结构表征 23 2.2.5 双鼠李糖脂的临界胶束浓度测定 23 2.2.6 细胞培养 23-24 2.2.7 细胞染毒 24 2.2.8 细胞活性检测 24 2.2.9 衰老相关β-半乳糖苷酶检测 24-25 2.2.10 AO/EB染色 25 2.2.11 DNA ladder 25 2.2.12 caspase-3检测 25-26 2.2.13 mRNA表达水平检测 26-28 2.2.14 蛋白含量测定 28 2.2.15 数据处理 28 2.3 实验结果 28-36 2.3.1 结构表征结果 28-30 2.3.2 双鼠李糖脂的临界胶束浓度 30-31 2.3.3 双鼠李糖脂对MCF-7细胞增殖的抑制作用 31-32 2.3.4 双鼠李糖脂对衰老相关β-半乳糖苷酶的影响 32 2.3.5 AO/EB染色 32-33 2.3.6 DNA ladder 33 2.3.7 双鼠李糖脂对caspase-3的影响 33 2.3.8 双鼠李糖脂对基因表达水平的影响 33-36 2.4 讨论 36-38 3 绿脓菌素的分离、纯化及抗肿瘤活性 38-57 3.1 材料与仪器 38-39 3.1.1 实验材料 38 3.1.2 主要试剂与药品 38 3.1.3 主要溶液配制 38-39 3.1.4 主要实验仪器 39 3.2 实验方法 39-44 3.2.1 绿脓菌素的分离纯化 39-40 3.2.2 细胞培养 40 3.2.3 细胞染毒 40 3.2.4 细胞活性检测 40 3.2.5 衰老相关β-半乳糖苷酶检测 40-41 3.2.6 细胞凋亡检测 41 3.2.7 活性氧检测 41-42 3.2.8 细胞抗氧化水平检测 42-44 3.2.9 caspase-3检测 44 3.2.10 mRNA表达水平检测 44 3.2.11 蛋白测定 44 3.2.12 数据处理 44 3.3 实验结果 44-54 3.3.1 绿脓菌素对肿瘤细胞存活率的影响 44-45 3.3.2 绿脓菌素对肿瘤细胞β-半乳糖苷酶的影响 45-46 3.3.3 AO/EB染色 46-47 3.3.4 细胞DNA损伤 47-49 3.3.5 绿脓菌素对肿瘤细胞内活性氧产生的影响 49 3.3.6 绿脓菌素对肿瘤细胞抗氧化水平的影响 49-51 3.3.7 绿脓菌素对caspase-3的影响 51 3.3.8 绿脓菌素对基因表达水平的影响 51-54 3.4 讨论 54-57 4 结论 57-58 4.1 结论 57 4.2 创新点 57-58 致谢 58-59 参考文献 59-68 附录 68
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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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