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miR-203对HaCaT细胞p63和SOCS3表达调控初步研究

作　者: 巩春玲
导　师: 燕秋
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: miR-203 p63 SOCS3 角质形成细胞银屑病
分类号: R758.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：银屑病(psoriasis)是严重影响人类身心健康的自身免疫性皮肤病。导致银屑病表皮细胞过度增殖和异常分化的确切原因尚未确定。miRNAs是内源性非蛋白编码单链小分子RNAs，主要功能为转录后水平抑制靶基因的表达。miRNAs对其靶基因的调节障碍可导致不同疾病的发生。miR-203具有高度皮肤特异性，在银屑病皮损中异常表达，有报道推测p63和SOCS3是其进化保守的靶基因。miR-203对p63和SOCS3的调节及其在角质形成细胞增殖、分化和银屑病发病机制中的作用尚不明确。STAT3和Notch信号通路在银屑病的发病中起着关键的作用，而p63和SOCS3是上述信号通路的2个重要调节子。本研究旨在通过将miR-203的模拟物和其抑制物转染人永生化角质形成细胞HaCaT细胞系，确定其对p63和SOCS3的调控机制、明确其与STAT3和Notch信号通路的关系及其在银屑病发病机制中的作用，确定它们的调控方式和相互关系，为其作为银屑病新的治疗靶标提供理论依据。方法：用miR-203的模拟物和抑制物(miR-203mimic和miR-203inhibitor)定量转染人角质形成细胞系HaCaT细胞。通过qRT-PCR、Western blot、流式细胞术方法检测p63、SOCS3、p-STAT3和Notch1基因及蛋白的表达水平；并用含TNF-α (20ng/ml)和IL-6(20ng/ml)的培养液处理HaCaT细胞，并以qRT-PCR法对miR-203的表达水平进行检测，观察细胞因子TNF-α和IL-6对miR-203表达水平的影响。结果：1. qRT-PCR检测p63、SOCS3、p-STAT3、Notch1的mRNA表达水平，其中转染miR-203mimic组与对照组相比SOCS3、Notch1、p-STAT3的mRNA表达上调，Notch1组间差异具有显著性(P <0.05)，p63mRNA表达水平无明显变化；转染miR-203inhibitor组与对照组相比SOCS3、Notch1、p-STAT3的mRNA表达下调，SOCS3和Notch1组间差异有显著性(P <0.05)，p63mRNA表达亦无明显变化。2. Western blot和流式细胞术方法检测蛋白表达，转染miR-203mimic的细胞，p63和SOCS3表达下降，p-STAT3和Notch1表达升高;转染miR-203inhibitor的细胞结果与之相反。3. HaCaT细胞经TNF-α和IL-6处理后，经qRT-PCR方法检测miR-203表达升高，差异具有显著性(P <0.05)。结论：miR-203的过表达，可以抑制p63和SOCS3表达，从而使STAT3持续激活，STAT3的磷酸化水平增加，导致角质形成细胞过度增殖。本研究为探讨miR-203对p63、SOCS3的调控机制及其与STAT3信号转导通路的关系提供了初步的实验基础，有助于了解miR-203在银屑病发病机制中的作用。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-13
材料和方法  13-23
  1. 材料  13-16
    1.1. 实验细胞  13
    1.2. 实验试剂  13-14
    1.3. 实验仪器  14-15
    1.4. 实验溶液配制  15-16
  2. 方法  16-23
    2.1. 细胞复苏  16
    2.2. 细胞传代  16-17
    2.3. 细胞冻存  17
    2.4. 细胞培养  17
    2.5. 细胞转染  17-18
    2.6. 转染效率检测  18
    2.7. 流式细胞术检测细胞 Notch1 表达  18-19
    2.8. qRT-PCR 检测 HaCaT 细胞中 p63，SOCS3，Notch1 mRNA 的表达情况  19-21
    2.9. Western blot 检测 HaCaT 细胞中 p63、p-STAT3 和 SOCS3 的表达  21-23
结果  23-31
  1. HaCaT 细胞转染效率的检测  23-24
  2. qRT-PCR 分析 HaCaT 细胞中 miR-203 对 p63 mRNA 表达的影响  24-25
  3. Western blot 方法分析 miR-203 对 p63 蛋白表达的影响  25-26
  4. qRT-PCR 分析 miR-203 对 p-STAT3 的影响  26
  5. Western blot 方法分析 miR-203 对 p-STAT3 的影响  26-27
  6. qRT-PCR 分析 miR-203 对 SOCS3 mRNA 在 HaCaT 细胞中表达的影响  27-28
  7. Western blot 方法分析 miR-203 对 SOCS3 蛋白表达的影响  28-29
  8. qRT-PCR 分析 miR-203 对 Notch1 mRNA 在 HaCaT 细胞中表达的影响  29-30
  9. 流式细胞术检测 Notch1 表达  30
  10. qRT-PCR 分析 TNF-α 和 IL-6 对 HaCaT 细胞中 miR-203 表达的影响  30-31
讨论  31-35
结论  35-36
参考文献  36-39
综述  39-49
  参考文献  46-49
致谢  49-50

miR-203对HaCaT细胞p63和SOCS3表达调控初步研究

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