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IL-17RC低甲基化影响葡萄膜炎的机制研究及中药治疗葡萄膜炎的临床体会

作　者: 吴文婷
导　师: 金明
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: CD8~+T细胞 DNA甲基化 IL-17RC 临床体会葡萄膜炎眼结节病中医药
分类号: R773.9
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

背景：结节病,是一种累及多系统并以非干酪样肉芽肿为病理特点的慢性疾病,是引发眼局部炎症的常见原因之一,高达24%的眼结节病患者会出现严重视力损害,其中10%可视力致残甚至失明,但早期干预可明显改善预后。眼结节病最主要的表现为葡萄膜炎。目前眼结节病的诊断仍存在诸多难点,皮肤、外周淋巴结以及肺部病理组织活检是诊断金标准,但侵入性方式无疑会给病人带来一定的伤害。因此,发现新的诊断标志物,用于提高诊断安全性和准确性,并应用于治疗,具有重要的临床意义。表观遗传学方法的出现,为研究疾病的发病机制开启了新的篇章,DNA甲基化是高等动物中普遍存在的基因表观遗传修饰方式之一。IL-17RC以跨膜蛋白形式存在于细胞膜上,作为共受体与IL-17亚型特异性结合,可以激活多条信号转导通路,促进炎症反应的发生。最新文献表明IL-17RC启动子区低甲基化在眼局部炎症、渗出、新生血管形成的过程中发挥了一定作用。我们推测,IL-17RC启动子区的DNA甲基化异常可能参与眼结节病的发生发展。葡萄膜炎是眼结节病最主要的表现形式,目前治疗以局部或者全身应用糖皮质激素为主,可联合免疫抑制剂以及生物制剂,但副作用均较明显,且易产生激素依赖性以及停药后反跳。中医药在治疗葡萄膜炎方面具有明显优势,值得中医工作者继承和发扬。目的：第一部分：分析IL-17RC启动子区DNA甲基化状态与眼结节病相关性,检测IL-17诱导IL-17RC表达的能力,初步探讨IL-17RC启动子区甲基化在眼结节病分子水平机制中的作用。第二部分：葡萄膜炎是眼结节病的最主要临床表现,目前西药治疗手段有限,故第二部分内容总结中医药治疗葡萄膜炎的临床经验,为治疗提供帮助。方法：第一部分：以眼结节病组和健康对照组为观察对象,采用甲基化敏感性限制性内切酶(Methylation sensitive restriction endonuclease, MSRE)PCR法观察两组IL-17RC启动子区DNA甲基化的水平；采用流式细胞术(Flow cytomerty)比较眼结节病患者和正常人外周血主要免疫细胞表面IL-17RC蛋白的表达；采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)比较眼结节病患者和正常人血清中IL-17的浓度；采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining, HE)观察静止期和炎症活跃期眼结节病患者眼组织的形态结构,采用免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)和逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测视网膜中IL-17RC蛋白和mRNA的表达；以抗CD3/抗CD28抗体活化增殖眼结节病患者和正常人CD8+T细胞并体外培养3天,其中刺激组和空白组分别加入IL-17、培养基,以流式细胞术比较其表面IL-17RC表达量的差异。第二部分：1.检索并阅读葡萄膜炎的中西医文献,研读金师发表的论文和著作。2.跟随金师门诊抄方,学习并记录老师临证时诊疗思路、用药特点,将其治疗葡萄膜炎的经验进行总结。结果：第一部分：1.相较于健康对照组,眼结节病患者IL-17RC启动子区DNA存在低甲基化修饰,差异有明显统计学意义(P<0.01)；2.外周血主要免疫细胞中,眼结节病患者CD8+T细胞表面表达的IL-17RC较健康对照组的表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)；3.与健康对照组相比,眼结节病患者中血清中IL-17浓度升高,结果具有显著统计学差异(P<0.01)；4.HE染色提示眼结节病患者眼组织中存在典型肉芽肿病变,且活跃的炎症组织有脉络膜视网膜瘢痕(Chorioretinal scar, C-R scar), IHC染色提示炎症活跃期视网膜组织可见IL-17RC的沉积,RT-PCR检测证实炎症活跃期患者的视网膜组织IL-17RC mRNA转录水平明显增高,差异具有显著统计学意义(P<0.01)；5.相较于未用IL-17刺激的空白组,经IL-17刺激后的眼结节病患者以及正常人的CD8+T细胞表面表达的IL-17RC均有所增多,但只有正常人刺激组的结果具有统计学差异(P<0.01)。第二部分：金明教授临证时主张以“西医辨病、中医辨证”为中心,用西医系统检查、眼科专科仪器与中医“望、闻、问、切”四诊并行,获取临床第一手病史及资料,且提倡切勿局限于眼部,应将眼病与整体相联,综合审视。葡萄膜炎是一类非常复杂之疾病,病因涉及外邪侵袭、湿热毒瘀内蕴、脏腑虚弱等,病位主要为肝胆肾,病机繁复、病情缠绵。在诊断方面,金明教授提出不仅要依据中医理论辨证分型,还应将病程细分为各期,并结合专科仪器,宏观辨证与微观检查互参,多层面把握病情。在辨证分型方面,金师不拘泥于目前常用分型,而是根据具体证候和病程,随机应变。在治疗方面,金师提出早期干预改善预后,在五轮之中尤重肝肾,并灵活运用龙胆泻肝汤(丸)、六味地黄类方,收效甚好。此外,金师还根据葡萄膜炎的激素应用特点,总结中药协同使用的规律：早期联合中药发挥类激素作用,可减轻激素用量,阻止疾病进展,此期中药多治以疏散风热、祛风胜湿,以散邪为主。发作期的特点是以大剂量口服激素控制炎症,其重型需加用免疫抑制剂,中药可减少由激素和免疫抑制剂带来的毒副作用,缩短病程,治则多为清泻肝胆实火和湿热、活血化瘀、渗湿解毒,攻补兼施。在后期的激素减量过程中,针对此时较易产生的激素依赖性以及突然停药带来的反跳,可突出中医药的扶正特性,调节机体免疫功能,协助激素平稳减量,巩固疗效,降低复发率及并发症的发生,此期因患者久服激素,正气亏虚,故中药多治以培补元气、滋补肝肾。结论：第一部分：1.眼结节病患者IL-17RC启动子区DNA存在低甲基化修饰,提示其与眼结节病的具有相关性,IL-17RC的低甲基化可作为眼结节病的表观遗传学标记物；2.外周血增多的IL-17RC+CD8+T细胞参与了眼结节病的发生发展过程；3. IL-17RC含量与炎症的活跃程度或疾病的严重程度相关联；4.眼结节病患者IL-17RC的表达增高可能是由于外周血高浓度的IL-17刺激所导致。第二部分：针对葡萄膜炎的治疗,应中西合璧,扬长避短,多管齐下,从而达到最优效果。

全文目录

目录  3-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-10
英文縮略词  10-12
文献综述  12-25
  综述一眼结节病中西医研究概况  12-20
  综述二 DNA甲基化在眼科的应用以及中药调节甲基化的研究进展  20-25
第一部分 IL-17RC低甲基化影响葡萄膜炎的机制研究  25-46
  前言  25-27
  材料和方法  27-37
    1 实验材料  27-30
      1.1 实验样本  27-28
      1.2 主要试剂  28-29
      1.3 主要溶液配制  29
      1.4 主要仪器设备  29-30
    2 实验方法  30-37
      2.1 甲基化敏感的限制性内切酶PCR法(MSRE-PCR)检测IL-17RC启动子甲基化状态  30-32
      2.2 流式细胞术检测外周血IL-17RC蛋白表达水平  32
      2.3 双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-17含量  32-33
      2.4 在IL-17A诱导下活化CD8+T细胞表达IL-17RC水平检测  33-34
      2.5 苏木精伊红及免疫组化染色检测眼组织形态及IL-17RC蛋白表达水平  34-35
      2.6 RT-PCR方法检测视网膜微切组织中IL-17RC表达  35-36
      2.7 图像处理  36
      2.8 统计学分析  36-37
  结果  37-43
    1 临床一般资料  37
    2 MSRE-PCR检测各组IL-17RC启动子区DNA甲基化状态  37-38
    3 各组外周血免疫细胞IL-17RC蛋白的表达  38-39
    4 各组血清中IL-17的含量  39-40
    5 各组活化CD8~+T细胞在IL-17A诱导下IL-17RC蛋白的表达  40-41
    6 免疫组织化学方法检测各组眼组织中IL-17RC蛋白及mRNA的表达  41-43
  讨论  43-46
    1 DNA甲基化与眼结节病的相关性  43
    2 IL-17RC基因低甲基化在眼结节病发生发展中的作用  43-46
第二部分中药治疗葡萄膜炎的临床体会  46-71
  前言  46-47
  1 葡萄炎的文献整理  47-53
    1.1 现代医学对葡萄膜炎的认识  47-48
      1.1.1 概念的诠释  47
      1.1.2 葡萄膜易引发炎症的特殊生理结构  47-48
    1.2 祖国医学对葡萄膜炎的认识  48-49
      1.2.1 古代医籍中葡萄膜炎的记载  48
      1.2.2 病因病机  48-49
    1.3 现代医家辨治葡萄膜炎的分析  49-53
      1.3.1 辨证分型分期  49-51
      1.3.2 用药规律  51-52
      1.3.3 葡萄膜炎常用中药的免疫调节作用  52-53
  2 中药治疗葡萄膜炎的临床体会  53-63
    2.1 定位眼部,联系整体  53-54
    2.2 中西医结合早期干预  54-55
    2.3 重视宏观与微观互参  55-56
    2.4 病证期结合治疗  56-57
    2.5 发挥中药的协同优势  57-59
    2.6 五轮统括,尤重肝肾  59-62
    2.7 灵活配伍龙胆泻肝汤(丸)  62-63
  3 医案浅析  63-71
    3.1 虹膜睫状体炎  63
    3.2 虹膜睫状体炎伴发周围静脉炎  63-65
    3.3 白塞氏病  65-68
    3.4 Vogt-小柳-原田综合征  68-71
全文总结  71-73
  1 结论  71
  2 创新点  71-72
  3 不足之处与展望  72-73
参考文献  73-82
致谢  82-83
个人简历  83

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