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色素上皮衍生因子抑制碱烧伤角膜新生血管的机制研究

作　者: 付月
导　师: 陆晓和
学　校: 南方医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 色素上皮衍生因子血管内皮生长因子细胞凋亡受体/配体角膜新生血管凋亡
分类号: R772.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)是多种眼表疾病如感染性角膜疾病、眼化学伤、热烧伤、非感染性角膜疾病角膜变性的显著特征之一,也是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素.CNV是临床上最常见、治疗最棘手的致盲性眼科疾病之一。其预后与角膜损伤的范围、时间、治疗方法密切相关,抑制新生血管的形成对保持角角膜透明性和免疫赦免状态意义重大,因而寻找安全、有效的治疗措施已成为眼科工作者的主要任务。CNV的发生机制尚不清楚,但是角膜血管生成受血管增生刺激因子和血管增生抑制因子的调节。一般认为,要维持角膜的无血管状态,角膜必须低表达血管生成因子,同时高表达血管生成抑制因子。这一动态平衡若被打破,便会引起角膜新生血管化。常见的血管增生刺激因子有血管内皮生长因(vascularendothelialgrowth factor-VEGF)成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管生成素、胰岛素样生长因子等,其中VEGF能使血管内皮细胞分裂、增殖、移行,毛细血管基底膜降解,形成新的血管腔,被认为是目前最有效的血管生成促进因子。常见的血管增生抑制因子有色素上皮衍生因子(pigment epithelium—derived factor,PEDF)、纤维蛋白溶酶原、血管抑素、内皮抑素等。其中PEDF能抑制血管内皮细胞移行和角膜血管化,被认为是目前最有效的血管生成抑制因子。目前临床上治疗CNV的新进展分为药物、基因和手术治疗,药物治疗包括VEGF相关药物、环氧化酶抑制剂、糖皮质激素、非甾体类抗炎药等。基因治疗包括重组人表皮生长因子、核转录因子抑制剂等。手术治疗包括局部处理过的牛心包遮盖治疗碱烧伤后角膜穿孔、羊膜移植、人工角膜和组织工程角膜等。因为VEGF是新生血管生成的主要促进因子,具有促进血管通透性增加,细胞外基质变性,血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。因此,阻断或抑制(?)VEGF表达的药物是一种有效的抗新生血管药物。根据阻断VEGF的不同途径主要分为抗VEGF抗体、抗VEGF适体、抗VEGF受体、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂和蛋白激酶C抑制剂。所以目前研究中的VEGF(?)目关药物有抗VEGF抗体、抗VEGF适体、酶抑制剂及其他抑制因子。其中其他VEGF抑制因子有PEDF、生长抑素、血管抑素、内皮抑素等。色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium—derived factor, PEDF)是人及动物眼中天然存在的一种糖蛋白,由视网膜色素上皮分泌,分子量为50KD,具有2个结构域,N端的神经营养区域和C端的丝氨酸蛋白酶抑制超基因家族反应环。早期对人胚和牛眼的研究发现视网膜RPE细胞可表达PEDF蛋白,并分泌到周围视网膜感光细胞间质(IPM)中,后来发现角膜组织和睫状上皮中也有PEDF的表达,尤其在角膜缘上皮中有强烈表达。对人睫状上皮细胞的研究发现在睫状上皮非色素细胞中可见很强的PEDF的免疫反应。这说明睫状上皮非色素细胞可分泌PEDF。另外眼的房水和玻璃体中也含有PEDF,房水的PEDF在生理情况下主要由睫状上皮细胞合成和分泌,而玻璃体内的PEDF主要由视网膜分泌,且含量很高。有研究表明视网膜感光细胞间基质(IPM)中PEDF浓度最高,约是玻璃体中浓度的10倍是房水中浓度的100倍。PEDF具有抗血管新生和神经保护的双重作用。以往对PEDF的神经保护作用及抗肿瘤作用研究较多,1999年Dawson DW等首次发现PEDF还具有很强的抑制血管的作用,可能是维持角膜、玻璃体等眼内组织无血管形成的主要原因,在玻璃体内是主要的血管增生抑制剂。研究结果显示PEDF对培养的内皮细胞如牛肾上腺、人真皮微血管内皮细胞和脐静脉血管内皮细胞等有特异性的抑制作用,PEDF对内皮细胞的抑制作用呈剂量依赖性,其半数有效剂量(median effective dose, ED50)为0.4mo1/L是目前用抑制内皮细胞移行方法测得的活性最高的抑制因子。Stellmach V等发现PEDF在抑制异常新生血管形成的同时,对已构建的视网膜血管不产生明显的损害；即使给予高剂量的PEDF,血管内皮细胞正常的形成和发育也不受影响。这显示PEDF只对正在进行病理性新生血管形成的血管组织产生损害。Duh E J等在小鼠缺血性视网膜病变模型研究中发现,玻璃体内注射2种重组的人PEDF,均可明显抑制视网膜新生血管从而证实了PEDF能够有效抑制视网膜新生血管的生成。鉴于PEDF在抑制视网膜新生血管方面的研究进展,目前国内外学者开始将PEDF应用于抑制角膜新生血管,已在大鼠和兔模型上取得一定成果。但PEDF抑制新生血管的机制目前尚未明确,目前研究认为PEDF可能是是通过以下途径发挥作用：1)抑制血管生成诱导剂,有研究表明PEDF可以直接通过自身受体和信号传导通路抑制UVEGF、血小板衍生因子、血管内皮生长因子、白介素酸性成纤维细胞生长因子等多种血管生成诱导剂的表达。2)抑制内皮细胞迁移,促进内皮细胞凋亡。Stellmach等认为PEDF可能是通过促进活化的血管内皮细胞凋亡,使血管内皮细胞对缺氧诱发的新生血管的信号不起反应。目前研究认为:PEDF是通过细胞凋亡受体配体(Fas/FasL)系统辨别新形成的血管内皮细胞和已经存在的血管内皮细胞从而选择性诱导新生血管内皮细胞凋亡。因此,我们的实验通过局部应用外源性PEDF,观察其对碱烧伤诱导角膜新生血管的影响；HE染色观察其对大鼠角膜病理改变的影响；免疫组化法检测角膜组织中VEGF、PEDF、Fas/FasL蛋白表达的变化及新生血管内皮细胞凋亡(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法-TUNEL法测定),旨在探讨其在抑制角膜血管新生过程中的可能作用机制。第一部分PEDF对碱烧伤大鼠角膜新生血管作用的观察和对新生血管化角膜中VEGF、PEDF表达的影响目的研究PEDF抑制碱烧伤大鼠角膜新生血管的生长情况,检测大鼠新生血管化角膜中VEGF、PEDF的表达量,初步探讨其抑制角膜新生血管的可能机制。方法健康成年雌性SD大鼠36只,碱烧伤法制作角膜新生血管模型,均以双眼制作碱烧伤模型。将CNV化大鼠随机分组(A、B)两组,A组：PEDF治疗组(12只)、B组：生理盐水对照组(12只)。并以正常大鼠做对照,C组：正常角膜组(12只)。分别于建模后第4天、7天、10天、14天裂隙灯显微镜下观察各组角膜新生血管的生长情况并计算角膜新生血管生长面积；并在建模后第4天、7天、10天、14天每组处死两只大鼠,HE染色后在光镜下观察新生血管化角膜病理组织形态,并采用免疫组化方法检测VEGF、PEDF蛋白的表达量。统计学分析：所有数据均采用SPSS13.0统计软件包进行分析。计量资料采用x±s表示。组间比较采用单因素方差分析,多个样本均数间两两比较SNK-q检验,计数资料用秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果建模后第4天、7天、10天、14天,生理盐水对照组CNV(x±s)的面积分别为(5.31±0.46)mm2、(16.90±0.06)mm2、(23.45±0.09)mm2、(28.26±0.02)mm2；而PEDF治疗组CNV(x±s)的面积分别为(2.60±0.15)mm2、(10.07±0.25)mm2、(20.92±0.05)mm2、(25.97±0.04)mm2；正常组未见新生血管。各个时间点两组CNV面积比较,PEDF治疗组均小于生理盐水对照组,P<0.05。两组内各个时间点之间CNV面积存在显著性差异,P<0.05。各时间点两组角膜HE染色观察结果：两组均在建模后第4天开始在角膜基质层观察到少量新生血管和炎性细胞浸润,第7-10天角膜基质层可见大量新生血管和炎性细胞,第14天可见角膜基质新生血管密度较前减少,可见较多成熟新生血管,内有红细胞。但两组CNV比较：生理盐水治疗组基质层可见大量新生血管,管腔大,有淋巴细胞和成纤维细胞的浸润,炎症反应较重；相比之下,PEDF组新生血管明显减少,炎症反应较轻。两组均在第10天观察到最多的角膜新生血管和炎症细胞侵润,P<0.05。各时间点三组VEGF、PEDF的免疫组化结果：PEDF在正常角膜上皮和内皮层均有微量表达,而VEGF在正常角膜微量表达或者不表达,两者在正常角膜表达阳性程度比较,PEDF>VEGF,P<0.05。碱烧伤后两种因子表达均上升,因此在各时间点两者在PEDF组和生理盐水组表达均高于正常角膜,P<0.05。建模后第7天,两组内VEGF的表达量明显高于其他时间点,P<0.05；建模后第10天,两组内PEGF的表达量明显高于其他时间点,P<0.05。建模后第4、7天,两组内PEDF的表达量均低于VEGF, P<0.05；建模后第10,14天,两组内PEDF的表达量均高于VEGF。各时间点PEDF在PEDF治疗组的表达量均高于生理盐水组,P<0.05；而各时间点VEGF在在PEDF治疗组的表达量均低于生理盐水组,P<0.05。碱烧伤后第4天和第7天,VEGF/PEDF<1,碱烧伤后第7天和14天,VEGF/PEDF>1。结论检测到内生性PEDF在角膜组织的确切表达。外源性PEDF的局部应用补充了内源性PEDF,增强和证实了PEDF抑制角膜新生血管的作用。发现碱烧伤促进了PEDF和VEGF的表达,两者都是先上升后下降趋势,VEGF在碱烧伤后第7天表达达到峰值,随后下降；而PEDF在第10天表达达到峰值,随后下降。且可以观察到,在新生血管初生到发展到极期(第0-7天),PEDF表达一直低于VEGF表达,即VEGF/PEDF>1,CNV生长；然而在新生血管成熟和消退期(第10～14天),PEDF表达开始并一直高于VEGF,即VEGF/PEDF<1,CNV消退。第7～10是VEGF/PEDF比值发生逆转性变化的时期,也是肉眼观察到的角膜新生血管生长最盛的时期。VEGF/PEDF比值的变化恰好可以反映在大体角膜CNV的变化观察中。因此,本实验可以证明,PEDF在正常角膜中确实存在,且具有抑制CNV的作用。外源性局部应用PEDF可以明显增强抑制CNV发生的作用。而VEGF/PEDF的比值变化结果可以初步推论PEDF可能是通过抑制VEGF的产生来发挥抑制CNV的作用的。因此PEDF抑制CNV的机制之一可能是通过某些信号转导通路抑制VEGF的表达。第二部分PEDF对碱烧伤大鼠新生血管化角膜中Fas、FasL表达及新生血管内皮细胞凋亡的影响目的检测局部应用PEDF滴眼对碱烧伤大鼠新生血管化角膜中Fas、FasL表达的影响及对新生血管化角膜中新生血管内皮细胞凋亡(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法———TUNEL法测定)的影响。方法健康成年雌性SD大鼠36只,碱烧伤法制作角膜新生血管模型,均以双眼制作碱烧伤模型。将CNV化大鼠随机分组(A、B)两组,A组：PEDF治疗组(12只)、B组：生理盐水对照组(12只)。并以正常大鼠做对照,C组：正常角膜组(12只)。分别于建模后第4天、7天、10天、14天每组处死三只大鼠,取下6只带角巩缘的完整角膜,分别行免疫组化方法检测Fas、FasL蛋白的表达量和TUNEL法检测角膜组织中新生血管内皮细胞的凋亡情况。统计学分析：所有数据均采用SPSS13.0统计软件包进行分析。计量资料采用x±s表示。组间比较采用单因素方差分析,多个样本均数间两两比较SNK-q检验,计数资料用秩和检验。P<0.05,为差异具有统计学意义。结果Fas、FasL在正常角膜均有微量表达,表达于角膜上皮层和内皮层。碱烧伤后,两种因子在两组新生血管化角膜中表达先上升后下降,但均高于正常角膜,P<0.05；第10天表达最高,明显高于其他时间点,P<0.05。各时间点,PEDF治疗组Fas、FasL表达均高于生理盐水组,P<0.05。TUNEL法染色三组角膜,正常角膜上皮未检测到凋亡的血管内皮细胞,另两组新生血管化角膜各时间点均可检测到凋亡的新生血管内皮细胞,PEDF治疗组明显高于生理盐水组,P<0.05。两组均在第10天检测到的凋亡新生血管内皮细胞计数最多,明显高于其他时间点,P<0.05。结论TUNEL法是目前检测凋亡的新方法,其检测到的新生血管内皮细胞凋亡的趋势和Fas/FasL表达的趋势一致,说明了新生血管化角膜中Fas/FasL的表达可能促进了新生血管内皮细胞的凋亡,从而促进了CNV的退化。Fas、FasL是凋亡受体配体,其表达量的升高可能诱导了新生血管内皮细胞的凋亡,促进了CNV的退化,其在第10天达到峰值,与上文PEDF的峰值一致,说明了PEDF抑制CNV的机制之二可能是通过诱导凋亡受体、配体(Fas/FasL)的表达来间接诱导新生血管内皮的凋亡,从而发挥抗CNV的作用。

全文目录

摘要  3-10
ABSTRACT  10-21
前言  21-29
  参考文献  26-29
第一部分 PEDF对碱烧伤大鼠角膜新生血管作用的观察和对新生血管化角膜中VEGF、PEDF表达的影响  29-47
  1 材料  29-31
  2 方法  31-34
  3 结果  34-38
  4 讨论  38-43
  参考文献  43-47
第二部分 PEDF对碱烧伤大鼠新生血管化角膜中Fas、FasL表达的影响及新生血管内皮细胞凋亡的影响  47-66
  引言  47
  1 材料  47-50
  2 方法  50-54
  3 结果  54-56
  4 讨论  56-63
  参考文献  63-66
全文总结与展望  66-69
附录一综述  69-79
  参考文献  76-79
附录二缩略词表  79-80
攻读硕士期间发表的论文和成果  80-81
致谢  81-82

色素上皮衍生因子抑制碱烧伤角膜新生血管的机制研究

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