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细丝蛋白A调控表皮生长因子受体活化在恶性黑色素瘤发病中的作用

作　者: 张凯
导　师: 朱铁年
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 恶性黑色素瘤细丝蛋白A 表皮生长因子受体核增殖抗原Ki-67 增殖转移
分类号: R739.5
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：多种因素影响恶性黑色素瘤的发生、发展，包括环境因素、遗传因素和种族因素等都扮演重要角色。大量临床、流行病学及遗传学研究揭示，恶性黑色素瘤属于异质性肿瘤，包含多种基因突变类型，可在阳光暴露程度不同的身体多部位发病，提示其发生受多致病因素影响。利用现代先进的基因检测技术，深入研究恶性黑色素瘤发病的分子机制，将有助于判断疾病预后和选择最佳治疗方案。表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）和表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor， EGFR）是参与正常细胞和异常细胞分裂、增殖、迁移和存活的关键分子。EGFR与配体结合后可发生同源或异源二聚体化，导致其胞内段受体酪氨酸激酶发生自身磷酸化，主要通过ERK、Akt和JNK通路传导活化信号。当其异常活化或降解抑制时，可导致包括肿瘤在内的多种疾病发生。有研究证明，许多人类肿瘤中均过表达EGFR，且EGFR的表达水平与治疗反应不佳、疾病恶化及存活率低相关。细丝蛋白A（Filamin A，FLNa）是第一个在非肌细胞中被发现的肌动蛋白结合蛋白。其可形成同源二聚体，与肌动蛋白交联构成动态三维立体结构。FLNa作为脚手架可锚定90余种伴侣分子，其中包括多种细胞膜受体，调控诸如细胞形状、细胞移动、胞内转运等多种细胞功能和生理过程。最近研究发现，肿瘤发生不仅与EGFR持续活化、蛋白降解抑制有关，并且与FLNa构成的复杂信号转导网络有关，可由于FLNa异常表达影响其与伴侣锚定联接，导致肿瘤发生。尽管已证实FLNa与导致恶性肿瘤的信号异常有关，但其具体机制仍有待研究。我们利用不表达FLNa的人恶性黑色素瘤M2细胞株和经FLNa基因转染M2细胞获得的稳定表达FLNa的M2A7细胞进行的实验结果显示，虽然M2细胞EGFR蛋白表达量明显高于M2A7细胞，但经EGF刺激后EGFR磷酸化的量却明显少于M2A7细胞。此结果提示，EGFR表达量的多少并不代表其活化程度，可能还有其它因素调控着EGFR的活化，临床上不能仅仅根据EGFR的表达量来评价肿瘤患者的预后，研究调控EGFR活化的新机制具有重要的理论和实用价值。为此，本实验拟通过质粒转染技术，改变人恶性黑色素瘤细胞FLNa的表达水平，观察FLNa表达变化对恶性黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响；接种裸鼠，观察FLNa表达变化对恶性黑色素瘤细胞成瘤能力的影响；通过蛋白印迹（western blot）及免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）检测FLNa表达变化对EGFR及其下游信号磷酸化水平的影响；收集临床资料，观察人恶性黑色素瘤组织中FLNa表达与预后之间的关系。以期揭示FLNa与恶性黑色素瘤发生和发展的分子机制，为FLNa成为恶性黑色素瘤临床诊断参考指标和基因治疗新靶点等提供理论依据。方法：1FLNa对人恶性黑色素瘤细胞株增殖、迁移及侵袭的影响体外培养不表达FLNa的人恶性黑色素瘤M2细胞及其稳定表达FLNa的亚克隆M2A7细胞；将表达FLNa-shRNA的质粒转染高表达FLNa的人恶性黑色素瘤UACC647细胞，经嘌呤霉素筛选获得沉默FLNa表达的UACC647(KD)细胞，利用western blot验证沉默效果。1.1体外检测FLNa对人恶性黑色素瘤细胞增殖能力的影响利用MTT法体外检测FLNa对细胞活力的影响。实验细胞分别接种于96孔板，血清饥饿4小时后，加入不同浓度EGF（4,20,100nM）培养44小时，加入MTT溶液继续培养4小时，弃去上清液，加入DMSO振荡溶解后置于酶标仪570nm处检测OD值。利用平板克隆法体外检测FLNa对细胞贴壁后克隆形成的影响。实验细胞吹打混匀为单细胞悬液后分别接种于35mm培养皿，在含1%或10%胎牛血清培养基及EGF刺激条件下培养2周，苏木素染色后，镜下观察并计数克隆形成数量。利用软琼脂克隆法体外检测FLNa对细胞非锚定增殖的影响。用含0.35%低熔点琼脂糖的培养基制备单细胞悬液后，分别接种于预先铺有含0.6%琼脂糖培养基的6孔培养板，在含1%或10%胎牛血清及EGF刺激条件下培养2周，镜下观察并计数克隆形成数量。1.2利用划痕法体外检测FLNa对人恶性黑色素瘤细胞迁移的影响实验细胞分别接种于96孔培养板并饥饿培养4小时。使用无菌移液器吸头在单层细胞上均匀划痕，漂洗脱落细胞。无或加入EGF（20nM）继续培养，定时观察并拍照记录至划痕愈合，以划痕初始宽度为1计算各时间点相对宽度值。1.3利用Transwell小室法体外检测FLNa对人恶性黑色素瘤细胞侵袭的影响预饥饿的实验细胞分别置于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清MEM或1640培养基。培养24小时后，上室未穿膜细胞用棉签擦去，已穿膜细胞用甲醇固定、HE染色，光镜观察并拍照计数。2FLNa对人恶性黑色素瘤细胞EGFR信号通路分子的影响预饥饿细胞分别接受EGF（20nM）刺激0、5、10、30分钟，加入蛋白裂解液提取总蛋白。将等浓度等体积蛋白样本经电泳后转移至PVDF膜。利用3%牛血清白蛋白或5%脱脂奶粉封闭PVDF膜，分别加入抗磷酸化酪氨酸、EGFR、磷酸化ERK、总ERK和-actin等一抗，4C过夜，次日加入相应二抗，曝光显影，使用ImageJ软件定量分析蛋白条带灰度值。裂解实验细胞，向蛋白裂解液分别加入小鼠抗EGFR抗体和小鼠IgG于4C过夜滚动混匀。次日加入蛋白G琼脂糖微珠滚动混匀。漂洗微珠后，经加热获取洗脱液，用抗磷酸化酪氨酸抗体进行western blot检测。3FLNa对人恶性黑色素瘤细胞裸鼠体内成瘤的影响将UACC647(ctrl)和UACC647(KD)细胞分别接种于5周龄雌性BALB/c裸鼠右后肢。成瘤后每周2次测量瘤体直径并称重。4周后处死裸鼠，剥取瘤组织并称重拍照。提取瘤组织总蛋白，利用western blot检测不同瘤组织EGFR磷酸化水平。石蜡包埋瘤组织，免疫组织化学法检测FLNa及Ki-67表达。两位病理学家独立判断FLNa和Ki-67的表达情况。采用H指数法半定量分析FLNa表达；统计500个肿瘤细胞内Ki-67表达情况，计算其阳性表达率。4FLNa和Ki-67在人恶性黑色素瘤组织中的表达从白求恩国际和平医院病理科选取30例恶性黑色素瘤组织标本，采用免疫组化计数分别检测FLNa和Ki-67的表达情况，并分析FLNa的表达水平与患者预后的关系。结果：1FLNa促进人恶性黑色素瘤细胞体外增殖、迁移和侵袭通过稳定质粒转染技术得到沉默FLNa表达的UACC647(KD)细胞株。蛋白印迹法检测，与亲本细胞组及阴性对照组相比，UACC647(KD)细胞FLNa的表达被抑制70%以上。通过MTT实验检测，在不同浓度EGF（4nM，20nM，100nM）刺激下，与不表达FLNa的M2细胞相比，表达FLNa的M2A7细胞均展示出更高的增殖能力；但是在无EGF刺激情况下，两者增殖能力基本相同。类似的是，随着将UACC647细胞FLNa沉默表达，在有或无EGF刺激下，其增殖能力均有所降低。平板克隆形成及软琼脂克隆形成实验均显示，在EGF刺激下，FLNa表达水平较高的M2A7和UACC647(ctrl)细胞形成克隆的能力均强于FLNa表达水平较低的M2和UACC647(KD)细胞。通过划痕实验检测，在有或无EGF刺激下，高表达FLNa的M2A7和UACC647(ctrl)细胞迁移能力均强于相应低表达FLNa的M2和UACC647(KD)细胞；其中在EGF刺激下，划痕后12小时M2A7细胞的划痕相对宽度值为0，而M2细胞划痕相对宽度值为0.58±0.03；划痕后15小时UACC647(ctrl)细胞的划痕相对宽度值为0，而UACC647(KD)细胞划痕相对宽度值为0.51±0.01。通过Transwell小室实验检测，与M2细胞相比，表达FLNa的M2A7细胞穿透Matrigel基质胶的侵袭能力约是其1.9倍(P <0.01)。与此一致的是，沉默FLNa表达的UACC647(KD)细胞的侵袭能力较UACC647(ctrl)细胞降低了1.8倍(P <0.01)。2FLNa对人恶性黑色素瘤细胞配体诱导的EGFR信号通路的影响通过Western blot检测，虽然不表达FLNa的M2细胞表达更多的EGFR，但EGF刺激后磷酸化EGFR水平却明显低于表达FLNa的M2A7细胞。后续进行的免疫沉淀实验也得到了类似的结果。检测EGFR下游信号通路中ERK磷酸化情况，发现在EGF刺激下，M2A7细胞中磷酸化ERK水平明显高于M2细胞。在UACC647(ctrl)细胞和沉默FLNa表达的UACC647(KD)细胞上进行的实验也得到一致的结果，随着FLNa表达水平降低，EGF引起的EGFR和ERK磷酸化水平明显下降，与UACC647(ctrl)细胞相比，EGF刺激10分钟后，UACC647(KD)细胞磷酸化EGFR比率降低了70%。免疫沉淀实验也证实了UACC647(ctrl)和UACC647(KD)细胞中EGFR磷酸化水平的区别。与UACC647(ctrl)细胞相比，沉默FLNa导致EGF引起的UACC647(KD)细胞磷酸化ERK比率显著降低1.4倍。由此推断， FLNa可增强EGF刺激引起的EGFR酪氨酸磷酸化水平，并活化其下游Ras-Raf-MEK-ERK通路。3FLNa促进人恶性黑色素瘤细胞裸鼠种植瘤生长通过在裸鼠皮下接种UACC647(ctrl)和UACC647(KD)细胞检测FLNa对人恶性黑色素瘤细胞体内增殖的影响。与UACC647(ctrl)相比，沉默FLNa表达的UACC647(KD)细胞在裸鼠体内的生长明显减慢。免疫组织化学法检测显示，在UACC647(ctrl)细胞形成的肿瘤组织中可见弥漫、深染的Ki-67沉着于胞核，而强阳性表达的FLNa信号分布于胞浆。与此相反的是， UACC647(KD)细胞形成的瘤组织中仅有弱阳性Ki-67和FLNa表达。经线性统计分析，FLNa的H指数为64.33±10.59，且与Ki-67表达呈正相关（r=0.88; P <0.01）。western blot检测显示，UACC647(KD)细胞所形成的肿瘤组织中磷酸化EGFR和ERK所占比率分别下降80%和46%。上述结果支持沉默FLNa抑制恶性黑色素瘤细胞体外、体内增殖的观点。4FLNa低表达预示恶性黑色素瘤患者较好预后经两位病理学家独立分析判断，30例恶性黑色素瘤标本中FLNa表达的H指数为69.77±5.17。经统计分析，FLNa表达与Ki-67表达正相关（r=0.60; P <0.01），而与总生存期呈负相关（r=-0.45; P=0.013）。选取H指数中位数分组，高表达FLNa组患者的总生存期明显缩短（中位生存期为594天），显著低于而低表达FLNa组患者（中位生存期为1949天；P=0.0011）。然而，本实验未发现FLNa表达与患者年龄、性别和转移复发之间的相关性。结论：1增加或沉默FLNa的表达可增强或抑制人恶性黑色素瘤细胞体外增殖、迁移和侵袭能力。2沉默FLNa表达可抑制人恶性黑色素瘤细胞在裸鼠体内的成瘤生长。3FLNa可通过增强EGF诱导的EGFR活化（磷酸化）及其下游信号通路的转导促进恶性黑色素瘤细胞的生长。4恶性黑色素瘤患者肿瘤组织中FLNa表达水平与Ki-67呈正相关，与总生存期呈负相关；FLNa低表达预示恶性黑色素瘤患者预后较好。

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