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针刺联合环磷酰胺对4T1乳腺癌小鼠肿瘤生长的影响及作用机制的初步探讨
作 者: 田叶红
导 师: 黄金昶
学 校: 北京中医药大学
专 业: 中西医结合临床
关键词: 4-T1乳腺癌 环磷酰胺 CD34MVD MMP-9HSP70PD-L1 肿瘤局部免疫 肿瘤微环境 Treg细胞 针刺
分类号: R737.9
类 型: 硕士论文
年 份: 2014年
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内容摘要
乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤,约占女性肿瘤的三分之一,致死率占女性肿瘤中的第二,占全身各种恶性肿瘤的7%-10%。每年全世界大约有130万人被诊断为乳腺癌,约40万人死于该病,其发生率正以每年3%的速度递增,患者群也渐趋于年轻化。乳腺癌主要是以手术治疗为主,而化疗、放疗等也作为极为重要的辅助治疗。但由于化疗药物的耐药和肿瘤本身的异质性或是其他原因,仍有部分乳腺癌患者复发或带瘤生存,如何消灭这些残存的瘤体和提高治疗疗效,一直是乳腺癌治疗的难点,因此对乳腺癌的研究具有深远的意义。随着实验针灸学的发展,关于针灸在免疫功能方面的影响,动物实验较为丰富,提示针灸可以提高免疫功能,从肿瘤形成与免疫系统的关系可以推断,针灸能给肿瘤患者带来益处。我们在临床工作中发现毫针瘤周围刺可以抑制肿瘤生长,配合化疗瘤体显著缩小甚至消失。基于针刺治疗肿瘤的既往文献研究和临床疗效观察,本实验的主要目的在于验证针刺联合环磷酰胺(CTX)治疗肿瘤的疗效,从针刺调节免疫力和改善肿瘤局部微环境方面,初步探索针刺抑瘤的作用机理。研究目的:研究针刺配合CTX对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用,通过比较各组病理学及流式细胞学变化,从针刺对全身免疫系统及肿瘤局部微环境的影响着手,观察针刺配合CTX对乳腺癌的治疗疗效,并探讨其可能的作用机制,为乳腺癌及其他难治性肿瘤提供实验依据。研究方法:取对数生长期的4T1乳腺癌细胞皮下注射于小鼠前肢腋窝后方,建立BALB/c小鼠4T1乳腺癌模型,随机分为4组,模型组(9只)、药物组(9只)、针刺组(10只)、针药组(10只)。当瘤积达5mm×5mm左右时,药物组小鼠腹腔注射CTX,针刺组小鼠瘤周围刺。观察抑瘤率;测定脾脏指数、胸腺指数;采用流式细胞仪(FCM)检测肿瘤组织中PD-L1表达和CD4+CD25+Treg细胞表达;运用HE染色观察肿瘤细胞形态、肿瘤组织坏死及浸润情况;免疫组化法(IHC)检测肿瘤组织中CD34标记的微血管密度(MVD),以及HSP70和MMP-9的表达情况。研究结果:1抑瘤率药物组、针刺组、针药组与模型组比较,瘤重明显减轻(P<0.05);针药组抑瘤率比药物组、针刺组显著升高(P<O.05);针刺组抑瘤率比药物组略升高(P>0.05)。据以上结果,可以认为CTX与针刺对肿瘤生长均具有一定的抑制作用,针刺联合CTX,其抑瘤作用更强,针刺可在一定程度上提高CTX的抑瘤作用。2脾脏指数和胸腺指数药物组脾脏指数较模型组减低(P<0.05);针刺组和针药组脾脏指数较模型组显著升高(P<0.05);针刺组脾脏指数比针药组明显升高(P<0.05);针刺组胸腺指数明显高于药物组(P<0.05),余各组小鼠胸腺指数虽与脾脏指数有相同的变化趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。据此可以认为,环磷酰胺等细胞毒类药物可明显抑制小鼠机体免疫力,针刺可提高免疫力,针刺联合CTX,可减低CTX等细胞毒性药物对机体的免疫抑制作用。3HE染色电镜观察肿瘤细胞形态、肿瘤组织坏死及浸润各组小鼠肿瘤细胞排列紊乱;肿瘤细胞大小不一,形态各异,可见形态奇特、体积大的瘤巨细胞;细胞核大小、形态及染色不一,胞核增大且核质比例失调,可见巨核、双核、多核,核染色深,染色质粗颗粒状;病理性核分裂象多见,呈不对称性、多极性分裂。从各组小鼠肿瘤组织结构和细胞的异型性看,4T1乳腺癌细胞恶性度高。但各组小鼠肿瘤异型性有差异,模型组肿瘤异型性明显大于其余三组,而针药组的异型性最小。针刺组坏死面积较药物组、针药组明显增大(P<0.05);药物组和针药组坏死面积无明显差异,与模型组比较有所减小,但无明显统计学差异(P>0.05)。从各组小鼠瘤体看,模型组最大,肿瘤生长越快,其内部营养供应不足,故会形成肿瘤细胞坏死,而针刺组瘤体较小,坏死程度最重,可以推断,瘤周围刺对可在某种程度上促进肿瘤细胞坏死,但联合CTX,未发现明显的协同作用。4肿瘤组织中CD34标记的微血管生成情况IHC结果显示,模型组CD34标记的微血管阳性表达面积和IOD值较药物组、针刺组、针药组明显升高(P<0.05);针药组与药物组、针刺组比较,阳性表达面积和IOD值明显减低(P<0.05);针药组OD值比模型组、药物组、针刺组明显降低(P<0.05);药物组与针刺组比较,阳性表达面积、OD值和IOD值均无明显差异(P>0.05)。据此可以认为,针刺和CTX对小鼠4T1乳腺癌细胞微血管生长均有一定的抑制作用,但针刺联合CTX,对微血管生成的抑制作用更强。5肿瘤组织中HSP70表达程度IHC结果显示,模型组HSP70阳性表达面积和IOD值较药物组、针刺组、针药组明显升高(P<0.05);针药组与药物组、针刺组比较,阳性表达面积和IOD值明显减低(P<0.05);模型组OD值比药物组、针刺组、针药组明显升高(P<0.05);药物组与针刺组比较,阳性表达面积、OD值和IOD值均无明显差异(P>0.05)。据此可以推测,针刺和CTX对小鼠HSP70的表达均有一定的抑制作用,针刺联合CTX,能更显著抑制HSP70的表达。6肿瘤组织中MMP-9表达程度IHC结果显示,模型组MMP-9阳性表达面积和IOD值较药物组、针刺组、针药组明显升高(P<0.05);药物组与针刺组、针药组比较,阳性表达面积和IOD值明显减低(P<0.05);针刺组OD值比模型组、针药组明显降低(P<0.05);药物组与模型组比较,OD值明显减低(P<0.05)。据此可以推测,针刺和CTX对小鼠MMP-9的表达均有一定的抑制作用,单纯针刺或针刺联合CTX,均显著抑制MMP-9的表达。7肿瘤组织中PD-L1表达情况FCM结果显示,药物组PD-L1阳性率和表达量较模型组明显升高(P<0.05);针刺组、针药组PD-L1阳性率和表达量较模型组升高,针药组PD-L1阳性率和表达量较针刺组高,但差异均无统计学意义(P>0.05)。通过上述结果,可以认为单纯CTX可提高肿瘤组织中PD-L1阳性率,发挥肿瘤免疫抑制效应,但配合针刺,从某种程度上可减轻CTX对肿瘤局部发挥免疫抑制效应。8CD4+CD25+Treg细胞在肿瘤组织中的表达FCM结果显示,模型组肿瘤组织中CD4+CD25+Treg细胞百分数比药物组、针药组明显增多(P<0.05);药物组和针药组CD4+CD25+Treg细胞百分数比针刺组明显减少(P<0.05);药物组CD44+CD25+Treg细胞百分数较针药组增加,但差异无统计学意义(P>0.05)。可以认为,单纯CTX或针药结合对肿瘤组织中CD4+CD25+Treg细胞的表达有一定的抑制作用,针刺对CD4+CD25+Treg细胞的表达无明显作用,针刺联合CTX未表现出协同作用。针药组CD25+表达强度比模型组明显下降(P<0.05);药物组、针刺组CD25+表达强度较模型组下降,针药组CD25+表达强度比药物组下降,但差异均无统计学意义(P>0.05),故可推测,单纯针刺和CTX对肿瘤局部免疫无明显作用,但针刺联合CTX可抑制肿瘤局部负性免疫调节。9不同实验干预周期病理及流式结果变化趋势随着干预时间的延长,针刺组HSP70和PD-L1的阳性表达均呈下降趋势,余三组各项指标变化趋势不明显或不统一。由此可以推测,针刺调节肿瘤局部微环境的长期疗效较好。结论:1本实验发现,针刺具有一定的抗肿瘤作用,联合药物,可起到协同增效作用。2针刺可在一定程度上提高机体的全身免疫力,联合药物,可减低环磷酰胺等细胞毒性药物的免疫抑制作用。3瘤周围刺对肿瘤局部微环境起到一个良性调节作用,具体体现在减少微血管的生成;下调浸润转移相关蛋白酶(HSP70、MMP-9)的表达;联合CTX,可从某种程度上降低负性免疫调节指标(Treg细胞、PD-L1)的阳性率和表达量。4本实验分别于干预第12天、15天、18天取材,发现随着干预时间的延长,瘤周围刺在肿瘤组织中HSP70和PD-L1表达量上,均呈一定的下降趋势,故可以认为,针刺改善肿瘤局部微环境的远期效果较好。如有可能,后续实验将进一步延长干预时间,增大样本量,并观察小鼠生存期。
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全文目录
目录 3-6 中文摘要 6-9 Abstract 9-13 中英文缩略词 13-15 综述一 针灸治疗恶性肿瘤的临床运用进展 15-25 1 改善手术放化疗副反应 15-18 1.1 消化道反应 15-16 1.2 骨髓抑制 16-17 1.3 内分泌治疗不良反应 17 1.4 其他不良反应 17-18 2 改善癌性疼痛 18-19 3 改善肿瘤相关症状 19 4 调节机体免疫 19-20 5 结语及展望 20-21 参考文献 21-25 综述二 针灸治疗恶性肿瘤的实验研究进展 25-31 1 抑制肿瘤生长 25-26 1.1 药物增效 25 1.2 抑制肿瘤淋巴血管生长 25 1.3 纠正活动性节律紊乱 25-26 1.4 免疫调节 26 1.5 其他 26 2 改善癌性疼痛 26-27 2.1 抑制脊髓背角GFAP表达 26-27 2.2 调节β-EP含量 27 2.3 其他 27 3 改善骨髓抑制 27-28 3.1 上调骨髓相关修复基因 27 3.2 调节造血细胞相关蛋白的表达 27-28 3.3 调节骨髓造血微环境 28 4 结语及展望 28-29 参考文献 29-31 实验研究部分 31-59 前言 31 1. 实验材料 31-33 1.1 细胞株 31 1.2 实验药品及针刺工具 31 1.3 试剂 31-32 1.4 仪器及设备 32 1.5 试剂配制 32-33 2 实验方法 33-38 2.1 实验动物的饲养 33 2.2 4T1乳腺癌细胞的复苏与培养 33 2.3 动物造模 33-34 2.4 动物分组及干预 34 2.5 实验取材 34-35 2.6 检测指标及方法 35-38 2.6.1 一般状态 35 2.6.2 抑瘤率 35 2.6.3 脾脏指数和胸腺指数 35 2.6.4 HE染色电镜观察肿瘤细胞形态、肿瘤组织坏死及浸润 35-36 2.6.5 IHC检测肿瘤组织中CD34、HSP70和MMP-9表达情况 36-37 2.6.6 FCM检测肿瘤组织中PD-L1、CD4~+CD25~+Treg细胞表达情况 37-38 2.7 统计学分析 38 3 结果 38-51 3.1 一般状况 38-39 3.2 抑瘤率 39 3.3 脾脏指数和胸腺指数 39-40 3.4 HE染色电镜观察肿瘤细胞形态、肿瘤组织坏死及浸润 40-41 3.5 肿瘤组织中CD34标记的微血管生成情况 41-43 3.6 肿瘤组织中HSP70表达程度 43-45 3.7 肿瘤组织中MMP-9表达程度 45-47 3.8 肿瘤组织中PD-L1表达情况 47-49 3.9 CD4~+CD25~+Treg细胞在肿瘤组织中的表达 49-51 4 讨论 51-56 4.1 针刺治疗肿瘤的可行性分析 51-52 4.1.1 针刺治疗肿瘤的传统医学溯源 51 4.1.2 现代医学对针灸治疗肿瘤的研究 51-52 4.1.3 针刺治疗肿瘤的意义 52 4.2 针刺联合CTX抑制肿瘤的可能机制 52-56 4.2.1 针刺联合CTX对全身免疫的影响 52-53 4.2.2 针刺联合CTX对肿瘤局部免疫的影响 53-54 4.2.3 针刺联合CTX对肿瘤微血管的影响 54-55 4.2.4 针刺联合CTX对浸润转移相关蛋白酶(MMP-9、HSP70)的影响 55 4.2.5 针刺联合CTX通过微环境抑制肿瘤的可能机制 55-56 4.3 对本实验针刺操作方法的探讨 56 5 结语 56-57 参考文献 57-59 致谢 59-61 个人简历 61
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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