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氯化镉对大鼠胰岛瘤INS-1细胞自噬和凋亡的影响

作　者: 李娜
导　师: 荣海钦
学　校: 济南大学
专　业: 内科学
关键词: 氯化镉 INS-1细胞 自噬 凋亡 活性氧
分类号: R736.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景当前心血管疾病、癌症和糖尿病已成为导致人类死亡的前三位死亡原因。其中环境污染为糖尿病发病的重要诱因。环境污染近年来日趋严重，同时糖尿病的发病率也逐年增加，而镉在重金属环境污染物中很常见并具有代表性。目前评估镉对健康的影响及建立作用于不同器官系统的浓度-反应模型的研究较多，如镉与癌症、肾脏和肝脏损伤、骨质疏松或软化、生殖系统影响的研究较广泛，而其与胰腺或糖尿病的研究甚少。与此同时，近年来自噬研究成为热点，其与免疫、炎症、感染、肿瘤、衰老及心血管病、肝脏疾病、肌肉疾病、神经退行变等领域的研究广泛，目前已有研究证实自噬亦与糖尿病和胰岛细胞相关，但研究较少，具体机制尚不清楚。自噬与糖尿病和胰岛细胞的关系及调控机制的研究可对开发临床治疗相关药物和为糖尿病及其并发症的防治提供新的思路有重要意义。本课题用不同浓度的氯化镉（CdCl2）干预体外培养的大鼠胰岛瘤细胞INS-1，并通过各种实验室方法检测其凋亡及自噬情况，从整体上研究氯化镉对胰岛细胞自噬、凋亡的影响，可为揭示镉对胰岛功能的损伤机理提供新的证据，而有关分子机制的揭示也可为修复胰岛损伤寻找新的治疗靶点。目的研究典型持久性有毒污染物CdCl2对大鼠胰岛瘤INS-1细胞自噬和凋亡的影响及二者的关系，同时探索可能的分子机制和参与因素。方法取处于对数期的INS-1细胞用于实验，分别用0、0.01、0.1、1μmol/L CdCl2处理细胞，48h后用Hochest染色法在显微镜下观察细胞形态变化，用磺酰罗丹明B（SRB）染色法检测CdCl2对INS-1细胞增殖的影响；用2’,7’-二氯荧光素二乙酸盐（DCFH-DA）作为荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）的水平变化；应用Western blot检测细胞自噬体膜上自噬标志分子-微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、凋亡标志蛋白-聚腺苷二磷酸核糖多聚酶（PARP）的切割带变化及检测（哺乳动物）雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的70KD的磷酸化的核糖体S6激酶（p70）、p70的磷酸化形式p-p70的变化，以明确CdCl2是否可诱导的INS-1细胞产生自噬及其是否通过mTOR依赖的信号通路；将INS-1细胞的自噬必需基因7（Atg7）通过siRNA介导的RNA干扰手段进行沉默，然后以1μmol/L CdCl2处理细胞，48h后应用Western blot检测细胞中Atg7、LC3-Ⅱ、PARP切割带，以确定CdCl2所诱导的自噬对INS-1细胞凋亡的影响；先用400μmol/L的活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理INS-1细胞，1h后加入1μmol/L CdCl2，48h后应用SRB染色法探明NAC处理后对INS-1细胞增殖是否有保护作用，Western blot检测LC3-Ⅱ蛋白、PARP切割蛋白，以确定CdCl2是否通过刺激活性氧的产生诱导INS-1细胞的自噬和凋亡。结果0.1、1μmol/L CdCl2干预24h后，细胞皱缩，变小变圆，凋亡增加，与对照组比较，存活率明显降低（P＜0.05）；与对照组相比，各浓度组LC3-Ⅱ和PARP切割带蛋白水平均增加，LC3-Ⅱ呈时间和剂量依赖性，PARP切割带呈时间依赖性，p70、p-p70蛋白水平无明显变化；与阴性对照组相比，Atg7siRNA组Atg7蛋白水平显著降低，与阴性对照+CdCl2组相比，Atg7siRNA+CdCl2组LC3-Ⅱ蛋白水平明显下降，而PARP切割带蛋白水平变化则与之相反；与对照组相比，各浓度组活性氧产生均明显增多，呈剂量依赖性；与CdCl2组相比，NAC+CdCl2组存活率明显增加（P＜0.05），LC3-Ⅱ、PARP切割带蛋白水平均下降。结论CdCl2可能通过刺激活性氧的增加而诱导INS-1细胞自噬和凋亡，且自噬是凋亡的抑制因素。

全文目录


研究生导师和课题指导小组介绍  5-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
主要符号表  13-14
第一章 前言  14-24
  1.1 镉  14-17
  1.2 自噬  17-24
第二章 材料与方法  24-32
  2.1 材料  24-26
  2.2 实验方法  26-31
  2.3 统计学分析  31-32
第三章 结果  32-37
  3.1 氯化镉可诱导 INS-1 细胞自噬和凋亡  32-34
  3.2 氯化镉诱导的 INS-1 细胞自噬对凋亡呈现抑制作用  34
  3.3 氯化镉可能通过 mTOR-非依赖途径诱导 INS-1 细胞自噬  34-35
  3.4 氯化镉刺激 INS-1 细胞内 ROS 的产生  35
  3.5 ROS 参与氯化镉诱导的 INS-1 细胞自噬和凋亡  35-37
第四章 讨论  37-44
  4.1 细胞的选取及培养  37-38
  4.2 自噬检测方法的选择  38-39
  4.3 自噬调控方法的选择  39-40
  4.4 活性氧的检测  40-42
  4.5 自噬信号通路的检测  42-43
  4.6 总结与展望  43-44
第五章 结论  44-45
参考文献  45-52
综述  52-62
  参考文献  59-62
攻读学位期间发表的学术论文  62-63
致谢  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 内分泌腺肿瘤 > 胰岛肿瘤
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