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胰腺癌细胞株中K-ras突变与Hedgehog通路的相关性及炎性细胞因子对其调节作用研究

作　者: 胡佳佳
导　师: 李兆申
学　校: 第二军医大学
专　业: 内科学
关键词: 胰腺癌 K-ras 基因突变 Hedgehog信号通路 转录因子 GLI1
分类号: R735.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


胰腺导管腺癌(简称胰腺癌)是消化系统常见的恶性肿瘤，占胰腺恶性肿瘤的90%以上，近年来发病率呈上升趋势，占欧美国家癌症致死病因的第四位。胰腺癌恶性程度高，早期症状不典型，大多数患者发现时已处于中晚期，失去手术机会。直径大于30mm的胰腺癌手术切除术后5年生存率为10%～20%，直径≤20mm的胰腺癌手术切除术后5年生存率为30%～60%，仅微小胰腺癌（直径≤10mm）手术切除术后5年生存率可达75%。Hedgehog信号通路在胰腺胚胎发育中发挥重要作用，在正常成熟胰腺中不表达或仅轻度表达，而在包括胰腺癌在内的绝大多数恶性肿瘤中均有不同程度的异常活化，可能是胰腺癌的核心致病机制之一。该通路的异常活化在胰腺癌发生的早期发挥着关键作用，对胰腺癌恶性生物学特性的维持极为重要。同时既往研究发现，约30%的人体肿瘤存在ras基因突变，以K-ras基因突变最常见，其中又以胰腺癌突变率最高，达75%-100%。在胰腺癌发生之前存在的小灶性增生、乳头状增生和原位癌的系列性导管损伤中，均可检测到K-ras基因异常，因而认为K-ras突变是胰腺癌发生的早期事件。研究还发现，Hedgehog信号通路配体Shh可以增强K-ras癌基因的活性，从而诱导胰腺癌发生，降低肿瘤细胞对持续性激活的Ras信号通路的依赖性。同时，胰腺癌细胞中K-ras癌基因可以通过RAF/MEK/MAPK信号通路直接激活Hedgehog信号通路。在一种可特异性激活胰腺上皮细胞中Hedgehog信号通路的小鼠模型中研究胰腺癌的发病机制，发现小鼠生长到成年后可形成胰腺未分化癌，通过激活Ras信号通路可进一步导致广泛性胰腺上皮内瘤变形成，并可提高肿瘤致死性，提示特异性激活胰腺上皮细胞中Hedgehog信号通路可以诱导胰腺癌。Ras和Hedgehog信号通路共同参与胰腺癌的形成，两者在胰腺癌发生、发展过程中相互作用。慢性炎症与胰腺癌的发生密切相关，研究发现核转录因子(nuclear factor kappa B，NF-кB)在慢性炎症相关胰腺癌中起中枢作用。Shh基因为NF-кB的直接转录靶基因，在Shh基因启动子区域和第1内含子内存在多个NF-кB结合位点，NF-кB和启动子结合后可转录性激活Shh。Nakashima等研究结果发现，在外科手术切除的胰腺导管腺癌及慢性胰腺炎的标本中NF-кB和Shh表达呈显著正相关。在胰腺癌细胞中阻断NF-кB后，可以抑制Shh mRNA的表达。两者在细胞增殖的过程中相互作用。同时Shh可以在白细胞介素-1、肿瘤坏死因子α和脂多糖的刺激作用下过度表达，从而使Hedgehog信号通路过度激活。同时，从正常胰腺导管细胞、慢性胰腺炎的扁平或者乳头状异型增生到胰腺癌，K-ras基因的突变率逐步升高。基于以上所述，本课题进行了不同胰腺癌细胞株中K-ras基因突变检测，Hedgehog信号通路活性检测与K-ras突变相关性分析，以及炎性因子对胰腺癌细胞株中Hedgehog信号通路活性的影响研究，分述如下。一、胰腺癌细胞株中K-ras基因突变检测目的：检测7株人胰腺癌细胞株是否存在K-ras基因突变及其突变类型，为后续实验打下基础。材料与方法：本实验室前期已建立了单管PCR定量检测K-ras基因第12、13密码子突变的方法，能有效检测K-ras基因第12、13密码子突变类型。在此基础上，通过改良优化，又建立了三管PCR法，用于检测7株胰腺癌细胞株（SW1990、Patu8988、CFPAC-1、Panc-1、Aspc-1、Capanc-2、Bxpc-3）中K-ras基因12、13密码子突变情况，同时与细胞株测序结果进行比较。结果：运用此方法对胰腺癌细胞株K-ras基因突变进行检测，其结果和测序结果完全吻合。4株胰腺癌细胞株Panc-1、Aspc-1、CFPAC-1、Patu8988为K-ras基因第12密码子突变；SW1990为第13密码子突变；Bxpc-3、Capanc-2第12、13密码子为野生型，无突变。结论：三管PCR法可有效检测K-ras基因突变，胰腺癌细胞株普遍存在K-ras基因突变，以12密码子突变最常见。二、胰腺癌细胞株中Hedgehog信号通路活性检测与K-ras突变相关性分析目的：检测7株人胰腺癌细胞株Hedgehog信号通路主要成员（Gli1、Smo、Shh、Ptch1、Sufu）表达情况，以了解Hedgehog信号通路在胰腺癌发生、发展中的作用，及其与K-ras突变的相关性。材料与方法：采用qRT-PCR法检测7株人胰腺癌细胞株中Hedgehog信号通路主要成员Gli1、Smo、Ptch1、Sufu的mRNA表达量，同时采用Western-blot方法对Gli1、Smo、Shh蛋白表达进行检测。结果：qRT-PCR检测显示，7株细胞株均可检测到Hedgehog信号通路成份（Gli1、Smo、Ptch1、Sufu mRNA），不同胰腺癌细胞株中Gli1、Smo、Ptch1的mRNA表达量差异有统计学意义，Aspc-1中Gli1、Smo、Ptch1mRNA表达水平较高，Bxpc-3及Capanc-2中Gli1、Smo mRNA表达水平较低，Ptch1mRNA表达水平中等。而Sufu mRNA表达量差异无统计学意义。Western-blot检测显示7株胰腺癌细胞株中均可见Gli1、Smo、Shh蛋白表达，尽管表达量各不相同。其中K-ras基因野生型细胞株Capanc-2、Bxpc-3中Hedgehog信号通路蛋白Gli1、Smo、Shh表达量最低，同qRT-PCR结果基本吻合；而K-ras第12密码子突变的细胞株Panc-1中Gli1、Smo、Shh蛋白表达量最高，Aspc-1中Gli1、Smo蛋白表达水平较低，同qRT-PCR结果不一致。结论：7株人胰腺癌细胞株中Hedgehog信号通路均存在不同程度的异常活化。在K-ras野生型细胞株（bxpc-3和capanc-2）中，Gli1和Smo的mRNA和蛋白表达水平均较突变型低。在K-ras突变型细胞株（aspc-1和panc-1）中，Gli1和Smo的mRNA与蛋白表达水平不一致。可能存在miRNA调控、蛋白质降解等转录后调控所导致。至于具体作用机制，还有待于进一步的探讨研究。三、炎性因子对胰腺癌细胞株中Hedgehog信号通路活性的影响研究目的：了解炎性因子刺激胰腺癌细胞株后，对Hedgehog信号通路活化状态的影响。材料与方法：分别用rTNF-α、LPS刺激K-ras基因突变的人胰腺癌细胞株Panc-1，分别于刺激后24h、48h收集细胞，抽提细胞总RNA及蛋白。利用qRT-PCR法检测刺激后细胞株中Hedgehog信号通路主要成员Gli1、Smo、Ptch1、Sufu的mRNA表达情况，同时用Western-blot方法对Gli1、Smo、Shh蛋白表达进行检测。结果：qRT-PCR结果显示，中等浓度的rTNF-α可在刺激后24h一过性显著低调Gli1mRNA表达，对其它成员（Smo、Ptch1和Sufu）mRNA表达无显著影响。低、中和高浓度的rTNF-α均可促进Shh和Smo蛋白表达。但对Gli1表达调控存在分离，低和中浓度促进表达，而高浓度抑制其表达。LPS对Gli1、 Smo、Ptch1和Sufu的mRNA表达均无显著影响，而对Gli1、 Smo和Shh的蛋白表达具有抑制作用。结论：中等浓度的rTNF-α可在刺激后24h一过性显著低调Gli1mRNA表达，对其它成员（Smo、Ptch1和Sufu）mRNA表达无显著影响。低、中和高浓度的rTNF-α均可促进Shh和Smo蛋白表达。但对Gli1表达调控存在分离，低和中浓度促进表达，而高浓度抑制其表达。LPS对Gli1、 Smo、Ptch1和Sufu的mRNA表达均无显著影响，而对Gli1、 Smo和Shh的蛋白表达具有抑制作用。通过上述研究，本课题得出以下结论：1、三管PCR法能有效检测K-ras基因的突变及其突变类型。胰腺癌细胞株普遍存在K-ras基因突变，主要集中在第12密码子。2、7株人胰腺癌细胞株中Hedgehog信号通路均存在不同程度的异常活化。在K-ras野生型（bxpc-3和capanc-2）中，Gli1和Smo的mRNA和蛋白表达水平均较突变型低。在K-ras突变型（aspc-1和panc-1）中Gli1和Smo的mRNA与蛋白表达水平不一致。可能存在miRNA调控、蛋白质降解等转录后调控所导致。3、中等浓度的rTNF-α可在刺激后24h一过性显著低调Gli1mRNA表达，对其它成员（Smo、Ptch1和Sufu）mRNA表达无显著影响。低、中和高浓度的rTNF-α均可促进Shh和Smo蛋白表达。但对Gli1表达调控存在分离，低和中浓度促进表达，而高浓度抑制其表达。LPS对Gli1、 Smo、Ptch1和Sufu的mRNA表达均无显著影响，而对Gli1、 Smo和Shh的蛋白表达具有抑制作用。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胰腺肿瘤
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