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基于cell-SELEX技术对人胆管癌细胞株QBC-939的核酸适配体筛选

作　者: 叶玲
导　师: 羊小海
学　校: 湖南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 核酸适配体 Cell-SELEX 人胆管癌细胞株 QBC-939
分类号: R735.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


肝门部胆管癌（HCCA）是一种胆道系统常见的恶性肿瘤，由于其发生部位特殊，呈浸润性生长及与肝门部血管关系密切等特点，给手术切除造成极大的困难。目前肝门部胆管癌的临床发现和诊断方法主要是建立在影像学方法上，用来检查组织细胞的形貌。这种方法存在灵敏度不高，特异性差等缺陷。因此，发展具有高特异性和高灵敏度的分子识别探针实现对肝门部胆管癌的早期检测和诊断、肿瘤标志物的发现、肿瘤发病机理研究具有非常重要的意义。核酸适配体是近年来发展起来的一种新型分子识别探针，具有识别范围广、稳定性好、分子量小、易于修饰等特点，目前在分析化学、生物医学等许多领域都得到了广泛应用。本文利用cell-SELEX技术，开展了对人胆管癌细胞株QBC-939核酸适配体筛选的工作，并对筛选得到的核酸适配体进行优化，主要内容如下：（1）基于cell-SELEX技术筛选人胆管癌细胞株QBC-939核酸适配体基于cell-SELEX技术，选择人胆管癌细胞株QBC-939为靶细胞，人肝癌细胞株SMMC-7721为对照细胞，优化了筛选条件，通过逐渐增加筛选的压力（如增加文库与靶标的比例、减少孵育时间、增加洗涤强度、增加反筛强度），经过14轮的反复筛选，对收集的文库进行验证，结果表明与人胆管癌细胞株QBC-939特异性结合的文库得到了高度富集，最终选取第13轮富集产物进行克隆测序。（2）核酸适配体优化以及不同核酸适配体对细胞表面结合位点的考察利用Clustal X2软件模拟通过筛选克隆已经得到的核酸适配体序列的二级结构，并根据序列二级结构的相似性进行归纳分类，共得到六大类不同结构的序列。分别选取六大类序列中的某一序列与细胞进行实验分析，结果获得两条解离常数均在纳摩尔级别且与人胆管癌细胞株QBC-939能特异性结合的核酸适配体。根据序列二级结构的差异性和相似性对获得的两条核酸适配体进行了序列优化，优化后获得一条高亲和力、高特异性的只有23nt的核酸适配体。最后，初步考察了温度对核酸适配体的影响和核酸适配体与细胞的结合位点。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
本文所用英文缩略词表  10-11
第1章 绪论  11-25
  1.1 核酸适配体及 SELEX  11-14
    1.1.1 核酸适配体性质及特点  11-12
    1.1.2 SELEX 原理与流程  12-13
    1.1.3 SELEX 靶标与类型  13-14
  1.2 肿瘤细胞核酸适配体的筛选及发展  14-16
    1.2.1 肿瘤细胞核酸适配体筛选优势  14
    1.2.2 已筛选的肿瘤核酸适配体种类  14-16
  1.3 肿瘤细胞核酸适配体在肿瘤诊治中的应用  16-23
    1.3.1 核酸适配体用于肿瘤标志物的发现  16-17
    1.3.2 核酸适配体用于肿瘤细胞的体外、体内成像  17-20
    1.3.3 核酸适配体在肿瘤治疗中的应用  20-23
  1.4 本论文拟开展的工作  23-25
第2章 基于 cell-SELEX 技术筛选人胆管癌细胞株 QBC-939 核酸适配体  25-43
  2.1 前言  25
  2.2 实验材料、仪器与方法  25-32
    2.2.1 实验材料与仪器  25-28
    2.2.2 细胞株的选择  28
    2.2.3 文库与引物的设计  28-29
    2.2.4 文库的预处理及细胞准备  29
    2.2.5 正筛选  29
    2.2.6 反筛选  29-30
    2.2.7 PCR 扩增  30
    2.2.8 ssDNA 文库的制备  30-31
    2.2.9 多轮筛选  31
    2.2.10 克隆和测序  31
    2.2.11 流式细胞分析  31-32
    2.2.12 激光共聚焦荧光成像  32
  2.3 实验结果与讨论  32-42
    2.3.1 PCR 条件的优化  32-33
    2.3.2 PCR 扩增筛选文库  33-34
    2.3.3 筛选文库富集程度的监测  34-35
    2.3.4 克隆测序与核酸适配体的序列分析  35-39
    2.3.5 流式细胞术表征核酸适配体与靶细胞的结合情况  39-40
    2.3.6 核酸适配体与细胞的荧光成像  40-41
    2.3.7 核酸适配体亲和力的测定  41-42
  2.4 小结  42-43
第3章 核酸适配体优化及不同核酸适配体对细胞表面结合位点的考察  43-55
  3.1 前言  43
  3.2 实验材料、仪器与方法  43-46
    3.2.1 实验材料与仪器  43-44
    3.2.2 流式细胞分析  44-45
    3.2.3 激光共聚焦荧光成像  45-46
  3.3 实验结果与讨论  46-54
    3.3.1 核酸适配体序列的优化与结果分析  46-49
    3.3.2 核酸适配体序列亲和力的测定  49-50
    3.3.3 核酸适配体序列特异性的考察  50-51
    3.3.4 温度对核酸适配体与靶细胞结合能力的影响  51-52
    3.3.5 酶对核酸适配体与靶细胞结合能力的影响  52-53
    3.3.6 不同核酸适配体与靶细胞结合位点的分析  53-54
  3.4 小结  54-55
结论  55-56
参考文献  56-65
附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文及专利  65-66
致谢  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胆囊、胆道肿瘤
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