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新的抑癌microRNA miR-520e的发现及其在肝癌中作用分子机制的研究
作 者: 张帅
导 师: 张晓东
学 校: 南开大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: miR-520e 肝癌 DNA甲基化 乙型肝炎病毒X蛋白 细胞增殖
分类号: R735.7
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的恶性肿瘤之一。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)慢性感染与肝癌的发生发展具有十分密切的关系,乙肝病毒表达的X蛋白(hepatitis B virusX protein, HBx)具有重要的致癌作用。MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为19~25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,广泛存在于真核生物中,可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的病理过程,是当前国际研究的热点。本论文首次发现并报道了在肝癌细胞中miRNA-520e(miR-520e)是一个新的抑癌microRNA,从以下三个方面对其进行了深入系统的研究,主要研究结果如下:第一部分:miR-520e对肝癌细胞生长的作用为了观察miR-520e与肝癌的关系,首先检测了miR-520e在肝癌细胞和临床肝癌组织中的表达情况。实时定量PCR结果显示,与正常肝细胞(L-O2和Chang liver)相比,miR-520e在肝癌细胞系(HepG2、H7402和MHCC-97L)中明显低表达。同时,miR-520e在23例临床肝癌组织中的表达水平显著低于其癌旁肝组织。上述结果提示,miR-520e是一个潜在的抑癌miRNA。然后,我们对miR-520e下调的分子机制进行了研究。生物信息学分析结果显示,在miR-520e DNA的上游调控区存在一个CpG岛。应用甲基化特异性PCR和亚硫酸盐测序PCR的方法证实,在肝癌细胞和肝癌组织中miR-520e上游调控区CpG岛存在超甲基化现象。进一步利用双荧光报告基因检测发现,miR-520e的CpG岛区具有启动子活性。因此,miR-520e DNA超甲基化是导致miR-520e表达下调的原因之一。然后,我们对miR-520e与肝癌细胞增殖的关系进行了探讨。应用MTT检测、EdU掺入增殖分析和克隆形成等实验方法,发现在肝癌细胞转染miR-520e和在正常肝细胞中转染miR-520e抑制剂后,miR-520e具有抑制肝癌细胞增殖的作用;裸鼠成瘤实验结果显示,转染miR-520e后肝癌细胞HepG2的成瘤能力明显下降;为了探讨miR-520e是否具有潜在的治疗作用,采用在接种肝癌细胞HepG2的荷瘤裸鼠的肿瘤组织内直接注射的方法,发现miR-520e可明显抑制肿瘤的生长,表明miR-520e在肝癌治疗中有潜在的应用价值。上述结果表明,miR-520e是一个新的抑癌miRNA。第二部分:miR-520e抑制肝癌细胞生长作用的分子机制通常miRNA通过其靶基因实现功能,为了阐明miR-520e抑制肝癌细胞生长作用的分子机制,我们对miR-520e的靶基因进行了探讨。运用生物信息学方法分析发现,核因子κB诱导激酶(NF-κB-inducingkinase, NIK)是miR-520e的一个潜在靶基因。利用双荧光报告基因、RT-PCR、real-time PCR和免疫印迹实验发现,miR-520e可以直接靶向NIK的3′UTR区域,从而抑制其翻译。研究发现,NIK在肝癌细胞系(HepG2,H7402和MHCC-97L)中和23例临床肝癌组织中呈高表达,并且与miR-520e的表达呈明显负相关,提示miR-520e可能通过其靶基因NIK发挥抑癌作用。研究发现,在肝细胞Chang liver中同时转染miR-520e抑制剂和NIK的siRNA时,NIK siRNA可以逆转miR-520e抑制剂导致的促进肝细胞生长的作用,支持了miR-520e可通过靶向NIK发挥抑制肝细胞生长的作用。进一步研究表明,在肝癌细胞中NIK激活ERK1/2进而促进NF-κB的转录和入核。因此,miR-520e可通过抑制NIK-ERK1/2-NF-κB信号转导通路发挥抑癌功能。第三部分:miR-520e在HBx促进肝癌细胞增殖中的作用为了进一步验证miR-520e具有抑癌作用,我们观察了miR-520e在HBx致癌中的变化和意义。利用qRT-PCR方法发现,miR-520e在稳定表达HBx的肝癌细胞系HepG2-X和稳定表达HBx肝细胞系L-O2-X中均呈下调表达。应用RNA干扰沉默HBx mRNA的表达,可导致miR-520e的表达水平上调,提示miR-520e参与了HBx的促肝癌细胞增殖作用。应用MTT检测发现,在HepG2-X肝癌细胞系和L-O2-X肝细胞系中过表达miR-520e,可阻断HBx的促肝癌细胞增殖的作用。应用生物信息学方法进行分析,结果显示丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶2(mitogen-activated protein kinase kinase kinase2,MEKK2)是miR-520e的一个潜在的靶基因。双荧光报告基因检测结果表明,miR-520e可以直接靶向MEKK2的3′UTR区域。RT-PCR和免疫印迹实验结果显示,miR-520e可以显著抑制MEKK2mRNA和蛋白的表达水平,进一步证实了MEKK2是miR-520e的直接靶基因。为了进一步探讨MEKK2是否参与miR-520e对肝癌细胞增殖的抑制作用,在转染miR-520e抑制剂的肝癌细胞中干扰MEKK2,发现MEKK2可明显阻断miR-520e抑制肝癌细胞增殖的作用。上述结果表明,HBx通过抑制miR-520e促进肝癌细胞的增殖,miR-520e通过其靶向MEKK2发挥作用。综上所述,本研究首次报道miRNA-520e是一个新的抑癌miRNA,通过其靶基因NIK抑制肝癌的增殖作用;miRNA-520e通过其靶基因MEKK2参与了HBx的致癌过程,进一步丰富了HBx致癌的分子机制研究。miRNA-520e抑制肝癌的作用及其分子机制研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
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全文目录
摘要 5-11 Abstract 11-30 第一章 引言 30-48 第一节 MicroRNAs 与肝癌 30-34 第二节 MicroRNAs 与表观遗传学调控 34-35 第三节 NF-κB 信号转导途径 35-40 第四节 乙肝病毒 X 蛋白与肝癌 40-46 1.4.1 乙肝病毒X蛋白 40-41 1.4.2 肝细胞肝癌 41-42 1.4.3 乙肝病毒X蛋白与肝癌发生的关系 42-46 第五节 研究内容、目的和意义 46-48 第二章 miR-520e 对肝癌细胞生长的作用 48-116 第一节 实验材料 49-53 2.1.1 肝癌组织样本及来源 49 2.1.2 菌株 49 2.1.3 细胞株 49-50 2.1.4 实验动物 50 2.1.5 质粒及microRNA 50 2.1.6 主要试剂 50-52 2.1.7 实验仪器 52 2.1.8 计算机软件 52-53 第二节 实验方法 53-84 2.2.1 细胞培养及传代 53-54 2.2.2 细胞株冻存 54-55 2.2.3 冻存细胞复苏 55-56 2.2.4 稳定细胞系的建立 56-57 2.2.5 质粒的小量提取 57-59 2.2.6 质粒的纯化和定量 59 2.2.7 细胞基因组提取 59-61 2.2.8 RNA提取及反转录cDNA合成 61-64 2.2.9 microRNA加尾及cDNA合成 64-65 2.2.10 实时定量PCR(Q-Real-time PCR) 65-66 2.2.11 DNA亚硫酸氢盐转化 66-68 2.2.12 miR-520e前体(pre-miR-520e)表达载体构建 68-73 2.2.13 miR-520e启动子及其突变体双荧光素酶报告基因载体构建 73-74 2.2.14 基因转染 74-77 2.2.15 MTT检测细胞生长 77-78 2.2.16 流式细胞仪样品制备及检测 78-79 2.2.17 平板克隆形成实验 79 2.2.18 EdU荧光显微镜检测细胞增殖 79-81 2.2.19 动物体内成瘤实验 81-82 2.2.20 双荧光素酶报告基因检测 82-84 2.2.21 对照实验 84 2.2.22 统计学分析 84 第三节 实验结果 84-111 2.3.1 miR-520e在肝细胞系及临床肝癌组织中低表达 84-87 2.3.2 DNA超甲基化是导致miR-520e下调的原因之一 87-99 2.3.3 miR-520e具有抑制肝癌细胞增殖的作用 99-106 2.3.4 miR-520e在动物体内具有抑制肝癌成瘤的作用 106-111 第四节 讨论 111-116 第三章 miR-520e 抑制肝癌细胞生长作用的分子机制 116-160 第一节 实验材料 116-120 3.1.1 菌株 116 3.1.2 细胞系 116 3.1.3 质粒及microRNA 116 3.1.4 siRNA干扰片段 116-117 3.1.5 抗体来源 117 3.1.6 主要试剂 117-119 3.1.7 实验仪器 119 3.1.8 计算机软件 119-120 第二节 实验方法 120-138 3.2.1 120 3.2.2 细胞的培养 120 3.2.3 细胞的冻存 120 3.2.4 冻存细胞的复苏 120 3.2.5 质粒的提取 120 3.2.6 质粒的纯化和定量 120 3.2.7 DNA提取 120-121 3.2.8 NIK 3′UTR 双荧光素酶报告基因载体构建 121-124 3.2.9 基因转染 124 3.2.10 RNA提取及反转录cDNA合成 124 3.2.11 实时定量PCR(qRT-PCR) 124-125 3.2.12 反转录PCR(RT-PCR) 125-126 3.2.13 免疫印迹检测 126-133 3.2.14 细胞总蛋白提取 133-134 3.2.15 细胞核蛋白提取 134-135 3.2.16 双荧光素酶报告基因检测 135 3.2.17 免疫荧光染色 135-137 3.2.18 对照实验 137 3.2.19 统计学分析 137-138 第三节 实验结果 138-156 3.3.1 NIK是miR-520e的靶基因 138-144 3.3.2 NIK参与miR-520e抑制肝癌细胞增殖 144-148 3.3.3 miR-520e抑制NIK-ERK1/2-NF-κB信号转导通路 148-156 第四节 讨论 156-160 第四章 miR-520e 在 HBx 促进肝癌细胞增殖中的作用 160-185 第一节 实验材料 161-165 4.1.1 菌株 161 4.1.2 细胞系 161-162 4.1.3 质粒及microRNAs 162 4.1.4 siRNA干扰片段 162 4.1.5 Western Blotting 抗体 162 4.1.6 主要试剂 162-164 4.1.7 实验仪器 164 4.1.8 计算机软件 164-165 第二节 实验方法 165-172 4.2.1 细胞培养 165 4.2.2 细胞株的冻存 165 4.2.3 冻存细胞的复苏 165 4.2.4 质粒的提取 165 4.2.5 microRNA加尾及cDNA合成 165-166 4.2.6 MEKK23′UTR载体构建 166-168 4.2.7 基因转染 168-169 4.2.8 RNA提取及cDNA合成 169 4.2.9 实时定量PCR(Real-time PCR) 169-170 4.2.10 MTT检测细胞生长 170 4.2.11 双荧光素酶报告基因检测 170-171 4.2.12 免疫印迹检测 171 4.2.13 对照实验 171 4.2.14 统计学分析 171-172 第三节 实验结果 172-181 4.3.1 HBx下调miR-520e的表达水平 172-175 4.3.2 miR-520e抑制HBx阳性的肝细胞和肝癌细胞的增殖 175-177 4.3.3 MEKK2是miR-520e的靶基因 177-180 4.3.4 MEKK2参与miR-520e抑制肝癌细胞增殖 180-181 第四节 讨论 181-185 第五章 小结 185-186 展望 186-187 参考文献 187-207 综述 207-269 1. microRNAs 简介 208-221 2. microRNAs 与肿瘤 221-237 3. 展望 237-239 参考文献 239-269 致谢 269-272 附录 常规溶液配制 272-277 个人简历、在学期间发表的论文与研究成果 277-282
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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