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HBx对小鼠肝前体细胞株Hp14.5的增殖和上表皮间质化的影响的影响

作 者: 芦永良
导 师: 冯涛
学 校: 重庆医科大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: HBx 肝前体细胞 wnt/β-catenin信号途径 上皮-间质转化
分类号: R735.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


目的利用HBx逆转录病毒感染小鼠肝前体细胞HP14.5,构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的小鼠肝前体细胞株。检测HBx对小鼠肝前体细胞增殖、细胞周期、上皮-间质转化,以及wnt/β-catenin信号通路的影响,探讨探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关性原发性性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生机制。方法重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,稻瘟菌素(Blasticidin)筛选出稳定表达HBx基因的细胞克隆并扩大培养(HP14.5/HBx组),通过RT-PCR和Western blot法鉴定HBx在肝前体细胞中稳定表达,设HP14.5/Rv(空质粒pSEEB-Flag感染组)及空细胞组HP14.5组为对照组。观察其形态变化,MTS比色法检测各组细胞的增殖活力,FCM法检测细胞周期中各时相所占的比例,通过实时定量PCR检测CyclinD1mRNA、 c-myc mRNA的表达量,Western blot法检测GSK3β、p-GSK3β(ser-9)、β-catenin、Cyclin D1以及c-myc等蛋白的表达情况,同时实时定量PCR检测及Western blot检测其间质细胞标志物N-cadherin、Snail、Vimentin和上皮标志物E-cadherin、CK18在mRNA和蛋白水平的表达,并采用划痕实验检测其迁移能力的变化。结果经抗生素筛选得到抗性细胞,通过RT-PCR和western bolt检测到HBx基因和蛋白阳性表达。与对照组相比:1、HP14.5/HBx细胞增殖活力显著增加(p<0.05); G1细胞比例明显减少(p<0.05),S期和G2细胞比例明显升高(p<0.05);Cyclin D1和c-myc mRNA的表达量显著升高(p<0.05); GSK3β蛋白水平表达无明显变化(p>0.05),p-GSK3β、β-catenin、Cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平显著升高(p>0.05)。2、稳定表达HBx基因后肝前体细胞由多角形变为长梭行;在HP14.5/HBx细胞中间质标志物N-cadherin、Snail、Vimentin在mRNA和蛋白水平表达均升高,具有统计学差异(p<0.05)而E-cadherin、CK18的mRNA和蛋白表达量显著降低(p<0.05),同时其迁移能力显著升高(p<0.05)。结论1.成功筛选出稳定表达HBx的肝前体细胞株HP14.5/HBx。2. HBx通过活化wnt/β-catenin信号途径促进肝前体细胞的增殖。3、HBx能诱导肝前体细胞发生上皮-间质转化,并增强其迁移能力。

全文目录


英汉缩略语名词对照  5-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-15
  参考文献  13-15
第一部分 HBX 稳定细胞株 HP14.5 的构建  15-26
  1 实验材料  15-18
  2 实验方法  18-23
  3 实验结果  23
  4 讨论  23-25
  参考文献  25-26
第二部分 HBX 对 HP14.5 细胞增殖、周期及 WNT/Β-CATENIN 信号通路的影响  26-33
  1 实验材料  26-27
  2 实验方法  27-29
  3 实验方法  29-30
  4 讨论  30-31
  参考文献  31-33
第三部分 HBX 诱导小鼠肝前体细胞上皮-间质转化  33-39
  1 材料  33
  2 方法  33-35
  3 结果  35-36
  4 讨论  36-37
  参考文献  37-39
全文总结  39-40
文献综述  40-46
  参考文献  42-46
附图  46-52
致谢  52-53
攻读硕士期间发表的论文  53-54

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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