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HBX基因对肝前体细胞增殖凋亡及分化的影响

作　者: 申利红
导　师: 冯涛
学　校: 重庆医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: HBX蛋白 HP14-19 分化凋亡肝细胞肝癌
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着肿瘤干细胞理论的提出，大量证据显示正常肝干细胞可以作为癌起源细胞在肝癌的发生发展中起作用。HBV病毒编码的HBx蛋白与肝癌的发生密切相关，但目前对HBx调节肝前体细胞生物学行为的研究甚少。本研究主要集中在HBx蛋白对肝前体细胞增殖凋亡和分化的影响。分述如下：1,HBx基因对肝前体细胞增殖及分化的影响：以腺病毒Ad-HBx和Ad-GFP感染肝前体细胞株（Hp14-19），RT-PCR和Western blot证实HBx蛋白在肝前体细胞内的表达；MTT联合流式细胞仪检测HBx蛋白对Hp14-19细胞增殖、周期和凋亡的影响；RT-qPCR和免疫荧光检测早期和晚期分化指标的变化；PAS染色观察细胞的分化成熟程度。结果：Ad-HBx能够有效感染Hp14-19并在细胞中表达，MTT结果显示HBx蛋白能够显著促进Hp14-19细胞增殖；FCM检测结果显示在Ad-HBx组中，S期细胞数明显增加，且细胞凋亡率明显降低；RT-qPCR和免疫荧光检测结果显示与对照组相比实验组（感染Ad-HBx）细胞分化早期指标穿膜蛋白（Delta like homolog，DLK）、肌酸激酶19（Creatine kinase19，CK19）和甲胎蛋白（Alpha fetal protein，AFP）表达降低减慢，而晚期指标CK18和白蛋白（Albumin，ALB）表达升高不明显；PAS染色阳性率降低。2,HBX对肝前体细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响：HBx基因的表达鉴定方法同前，Hoechst33342染色观察细胞核的改变，结合FCM法，Tunel法检测细胞的凋亡情况;real-time PCR和Western-blot检测凋亡相关因子Bax, Bcl2,mcl-1在mRNA和蛋白水平表达。结果：在Ad-HBX组中，Hoechst33342结果显示细胞核呈现固缩且边缘化细胞凋亡特征性改变数量减少；Tunel结果显示细胞凋亡率降低；real-timePCR和Western-blot结果显示Bcl2、mcl-1在mRNA和蛋白表达量增高，而促凋亡因子Bax表达降低。3,乙肝病毒X蛋白对肝前体细胞中β-catenin表达及定位的影响：HBx基因的表达鉴定方法同前，荧光定量PCR检测Hp14-19细胞中β-catenin的表达变化；免疫细胞化学检测β-catenin定位改变；Western-blot检测HBX，糖原合成酶激酶3β（glycogen synthasekinase3β，t-GSK3β）、磷酸化GSK3β（phospho-GSK3β，p-GSK3β）、β-连环素（β-catenin）蛋白表达。结果：感染Ad-HBX后，t-GSK3β在蛋白水平上无明显变化，而p-GSK3β蛋白表达量增加,同时β-catenin在基因和蛋白水平上也表达增高；在Ad-HBX组中β-catenin在细胞质中大量积聚，且有向细胞核中转位的趋势。综上，本研究发现，与对照组相比，Ad-HBX组肝前体细胞增殖明显增快，凋亡率显著降低，分化成熟的肝细胞数也明显下降，β-catenin表达量明显增加。这提示HBx蛋白可抑制肝前体细胞凋亡，促进细胞增殖，抑制细胞分化，激活WNT/β-catenin信号途径，从而在HBV相关性肝癌的发生发展中起着重要的作用。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
前言  13-16
  参考文献  14-16
第一部分 HBx 基因对肝前体细胞增殖及分化的影响  16-26
  1 实验材料和方法  16-19
  2 实验结果  19-24
  3 讨论  24-26
第二部分 HBx 蛋白对 Hp14-19 细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响  26-33
  1 实验材料和方法  26-28
  2 实验结果  28-30
  3 讨论  30-33
第三部分乙肝病毒 X 蛋白对肝前体细胞中β-catenin 表达及定位的影响  33-40
  1 实验材料和方法  33-35
  2 实验结果  35-38
  3 讨论  38-40
全文总结  40-42
参考文献  42-45
文献综述  45-51
  参考文献  47-51
致谢  51-52
硕士期间发表论文情况  52-53

HBX基因对肝前体细胞增殖凋亡及分化的影响

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