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慢病毒介导RNA干扰对慢性粒细胞白血病增殖的影响

作 者: 潘彦鹏
导 师: 郝新宝;曹献英
学 校: 海南大学
专 业: 生物化工
关键词: 慢病毒 bcr/abl基因 P210bcr/abl 增殖
分类号: R733.72
类 型: 硕士论文
年 份: 2014年
下 载: 2次
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内容摘要


目的:通过慢病毒载体介导靶向bcr/abl融合基因的体外的RNA干扰作用,研究其对K562细胞增殖活性的影响。为后续研究以及临床治疗提供依据。方法:通过4质粒共转293T细胞,包装携带干扰片段的慢病毒,通过慢病毒转染K562细胞,把干扰片段整合到K562细胞基因组中,达到持续治疗的效果。利用反转录PCR及Western blotting验证RNAi对融合基因bcr/abl以及其编码的P210蛋白的影响。采用CCK-8法、软琼脂细胞集落形成实验检、细胞周期检测、和BrdU掺入实验检测RNA干扰对K562细胞的影响。通过小鼠成瘤实验检查细胞体内成瘤能力。结果:Real-time PCR及Western blotting实验结果显示:B/A1、B/A2、B/A3实验组细胞与空白组细胞相比较bcr/abl mRNA表达和P210bcr/abl蛋白表达有明显的降低,而阴性对照组与空白组相比变化不大。CCK-8实验显示:阴性对照GFP组培养后24h和48h与空白组相比变化不大,而实验组B/A1、B/A2和B/A3组均对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。软琼脂细胞集落形成实验与空白组相比,阴性对照组几乎没有影响,B/A1组、B/A2组、和B/A3组抑制率分别为空白组的44.3%、30.1%和34.7%。慢病毒介导bcr/abl基因RNAi实验组与对照组相比K562细胞中bcr/abl和P210bcr/abl融合蛋白表达明显下调,增殖率降至对照组的46.4%、41.5%和33.0%。细胞周期检测结果显示:B/A1组、B/A2组和B/A3组G0/G1细胞明显多于空白对照组,阴性对照组和空白组没有明显的差别。BrdU掺入实验结果显示:B/A1组、B/A2组、和B/A3组BrdU掺入细胞的阳性细胞率明显低于空白组。B/A1组体小鼠体内成瘤能力明显低于对照GFP组。结论:慢病毒载体介导靶向bcr/abl融合基因的体外的RNA干扰,可明显的抑制K562细胞的增殖,有望成为治疗慢性粒细胞白血病的有效方法。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
1 前言  8-13
  1.1 慢性粒细胞白血病的发病机制和治疗现状  8-9
    1.1.1 慢性粒细胞白血病发病的分子基础  8
    1.1.2 慢性粒细胞白血病的治疗现状  8-9
  1.2 RNA干扰应用现状  9-10
  1.3 RNA干扰存在的问题  10-11
    1.3.1 RNA干扰技术存在脱靶效应和免疫反应的问题  10
    1.3.2 转染方法和转染效率问题  10-11
  1.4 研究思路  11-13
2 实验材料、试剂与仪器  13-16
  2.1 实验材料  13
  2.2 试剂  13-14
  2.3 主要仪器  14-16
3 慢病毒的包装  16-24
  3.1 试验方法  19-21
    3.1.1 热激法转化感受态  19
    3.1.2 抽提质粒  19-20
    3.1.3 琼脂糖凝胶电泳  20
    3.1.4 包装慢病毒  20
    3.1.5 病毒活力检测  20-21
  3.2 结果  21-22
    3.2.1 所需质粒的成功制备  21
    3.2.2 慢病毒的成功包装  21-22
  3.3 讨论  22-24
4 K562细胞体外的增殖检测  24-39
  4.1 试验方法  24-30
    4.1.1 细胞转染  24
    4.1.2 bcr/ab/mRNA表达水平的检测  24-25
    4.1.3 融合蛋白表达的检测  25-28
    4.1.4 细胞增殖能力检测  28
    4.1.5 细胞克隆形成检测  28-29
    4.1.6 细胞周期的检测  29
    4.1.7 BrdU掺入法检测K562细胞DNA合成  29-30
  4.2 结果  30-37
    4.2.1 RNA干扰对bcr/ab/mRNA表达的影响  30
    4.2.2 RNA干扰对bcr/ab/融合蛋白p210~(bcr/abl)表达的影响  30-31
    4.2.3 RNA干扰对K562细胞增殖的影响  31-32
    4.2.4 RNA干扰对K562细胞集落形成的影响  32-33
    4.2.5 RNA干扰对K562细胞周期的影晌  33-35
    4.2.6 RNA干扰对BrdU掺入K562细胞DNA的影响  35-37
  4.3 讨论  37-39
5 小鼠成瘤实验  39-42
  5.1 试验方法  39
    5.1.1 NOD/SCID小鼠的饲养  39
    5.1.2 小鼠皮下种植K562细胞  39
    5.1.3 肿瘤生长的观察  39
  5.2 结果  39-41
  5.3 讨论  41-42
6 结论  42
7 工作展望  42-43
参考文献  43-47
致谢  47-48
硕士期间发表的论文  48

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 慢性白血病
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