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慢病毒介导RNA干扰对慢性粒细胞白血病增殖的影响
作 者: 潘彦鹏
导 师: 郝新宝;曹献英
学 校: 海南大学
专 业: 生物化工
关键词: 慢病毒 bcr/abl基因 P210bcr/abl 增殖
分类号: R733.72
类 型: 硕士论文
年 份: 2014年
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内容摘要
目的:通过慢病毒载体介导靶向bcr/abl融合基因的体外的RNA干扰作用,研究其对K562细胞增殖活性的影响。为后续研究以及临床治疗提供依据。方法:通过4质粒共转293T细胞,包装携带干扰片段的慢病毒,通过慢病毒转染K562细胞,把干扰片段整合到K562细胞基因组中,达到持续治疗的效果。利用反转录PCR及Western blotting验证RNAi对融合基因bcr/abl以及其编码的P210蛋白的影响。采用CCK-8法、软琼脂细胞集落形成实验检、细胞周期检测、和BrdU掺入实验检测RNA干扰对K562细胞的影响。通过小鼠成瘤实验检查细胞体内成瘤能力。结果:Real-time PCR及Western blotting实验结果显示:B/A1、B/A2、B/A3实验组细胞与空白组细胞相比较bcr/abl mRNA表达和P210bcr/abl蛋白表达有明显的降低,而阴性对照组与空白组相比变化不大。CCK-8实验显示:阴性对照GFP组培养后24h和48h与空白组相比变化不大,而实验组B/A1、B/A2和B/A3组均对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。软琼脂细胞集落形成实验与空白组相比,阴性对照组几乎没有影响,B/A1组、B/A2组、和B/A3组抑制率分别为空白组的44.3%、30.1%和34.7%。慢病毒介导bcr/abl基因RNAi实验组与对照组相比K562细胞中bcr/abl和P210bcr/abl融合蛋白表达明显下调,增殖率降至对照组的46.4%、41.5%和33.0%。细胞周期检测结果显示:B/A1组、B/A2组和B/A3组G0/G1细胞明显多于空白对照组,阴性对照组和空白组没有明显的差别。BrdU掺入实验结果显示:B/A1组、B/A2组、和B/A3组BrdU掺入细胞的阳性细胞率明显低于空白组。B/A1组体小鼠体内成瘤能力明显低于对照GFP组。结论:慢病毒载体介导靶向bcr/abl融合基因的体外的RNA干扰,可明显的抑制K562细胞的增殖,有望成为治疗慢性粒细胞白血病的有效方法。
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全文目录
摘要 4-5 Abstract 5-8 1 前言 8-13 1.1 慢性粒细胞白血病的发病机制和治疗现状 8-9 1.1.1 慢性粒细胞白血病发病的分子基础 8 1.1.2 慢性粒细胞白血病的治疗现状 8-9 1.2 RNA干扰应用现状 9-10 1.3 RNA干扰存在的问题 10-11 1.3.1 RNA干扰技术存在脱靶效应和免疫反应的问题 10 1.3.2 转染方法和转染效率问题 10-11 1.4 研究思路 11-13 2 实验材料、试剂与仪器 13-16 2.1 实验材料 13 2.2 试剂 13-14 2.3 主要仪器 14-16 3 慢病毒的包装 16-24 3.1 试验方法 19-21 3.1.1 热激法转化感受态 19 3.1.2 抽提质粒 19-20 3.1.3 琼脂糖凝胶电泳 20 3.1.4 包装慢病毒 20 3.1.5 病毒活力检测 20-21 3.2 结果 21-22 3.2.1 所需质粒的成功制备 21 3.2.2 慢病毒的成功包装 21-22 3.3 讨论 22-24 4 K562细胞体外的增殖检测 24-39 4.1 试验方法 24-30 4.1.1 细胞转染 24 4.1.2 bcr/ab/mRNA表达水平的检测 24-25 4.1.3 融合蛋白表达的检测 25-28 4.1.4 细胞增殖能力检测 28 4.1.5 细胞克隆形成检测 28-29 4.1.6 细胞周期的检测 29 4.1.7 BrdU掺入法检测K562细胞DNA合成 29-30 4.2 结果 30-37 4.2.1 RNA干扰对bcr/ab/mRNA表达的影响 30 4.2.2 RNA干扰对bcr/ab/融合蛋白p210~(bcr/abl)表达的影响 30-31 4.2.3 RNA干扰对K562细胞增殖的影响 31-32 4.2.4 RNA干扰对K562细胞集落形成的影响 32-33 4.2.5 RNA干扰对K562细胞周期的影晌 33-35 4.2.6 RNA干扰对BrdU掺入K562细胞DNA的影响 35-37 4.3 讨论 37-39 5 小鼠成瘤实验 39-42 5.1 试验方法 39 5.1.1 NOD/SCID小鼠的饲养 39 5.1.2 小鼠皮下种植K562细胞 39 5.1.3 肿瘤生长的观察 39 5.2 结果 39-41 5.3 讨论 41-42 6 结论 42 7 工作展望 42-43 参考文献 43-47 致谢 47-48 硕士期间发表的论文 48
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 慢性白血病
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