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分子机器在肿瘤标志物检测中的应用研究

作　者: 崔仰仰
导　师: 王卫
学　校: 青岛科技大学
专　业: 应用化学
关键词: DNA分子机器 MicmRNAs 分子信标滚环复制
分类号: R730.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

MicroRNAs (miRNAs)是一类内生的非蛋白编码RNA分子,大约18-24核苷酸长,在植物、人类和动物的组织中都有发现,通过与mRNA3端非编码区绑定结合导表现致mRNA退化或者抑制,所以miRNAs在转录后基因调控中扮演着重要作用。miRNAs在癌症检测和键入方面有着重要意义,发展灵敏的、特异性的、定量的、低成本的检测miRNAs的方法是很有必要的。分子信标(MB),一种专门设计的DNA发夹结构,已经被广泛的运用于生物传感器的发展,DNA、RNA、蛋白质、金属离子甚至肿瘤细胞等靶的分析检测。本文主要开展了以下两个方面的工作：一、基于哑铃型探针滚环-剪切-复制技术检测miRNA的研究本章基于哑铃型探针滚环-剪切-复制技术,建立了一种高效的超灵敏免标记检测miRNAs的方法(以let-7a miRNA作为分析物)。该方法通过哑铃探针绑定目标miRNAs环化,进而引发滚环循环放大(RCA)和一个自发的剪切-聚合-取代分子机器过程,生成大量的HRP-DNA模拟酶序列,可与hemin结合,以ABTS2-H2O2为反应底物,产生紫外-可见信号。本方法灵敏度高(检测限可达1zmoD、线性范围宽(可达9个数量级)、特异性号(可检测单碱基错配)、操作简单(仅需一个探针和三种酶),并成功应用于let-7a miRNA实际样品的检测(人体肺部组织总RNA),为1miRNAs用于基因表达和分子诊断,特别是癌症早期诊断提供了一种新方法。二、基于自组装DNA分子机器循环放大技术检测DNA, Ramos细胞、溶菌酶的研究本章基于自组装DNA分子机器循环放大技术,建立了一种高效的检测靶DNA的方法,该方法通过靶DNA与茎环1反应打开茎环,再与茎环2、circlel杂交成环,在DNA聚合酶和DNA内切酶存在下,一边发生滚环复制,一边发生DNA剪切-复制扩增,生成大量HRP-DNA模拟酶,与hemin特异性结合,以ABTS2-H2O2为反应底物,产生紫外-可见信号。从而实验了对靶DNA的免标记的高灵敏检测,并进一步将此方法运用到了Ramos细胞、溶菌酶的检测。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
目录  6-9
第一章前言  9-27
  1.1 脱氧核糖核酸  9-12
    1.1.1 DNA的变性与复性  11-12
    1.1.2 小分子与DNA之间的作用  12
  1.2 miRNAs的研究  12-17
    1.2.1 miRNAs的特征  13-14
    1.2.2 miRNAs的生成过程  14-16
    1.2.3 miRNAs的功能  16-17
    1.2.4 miRNAs的展望  17
  1.3 DNA分子机器  17-22
    1.3.1 链交换反应的DNA分子机器  18-19
    1.3.2 分子镊子  19-20
    1.3.3 DNA的转动装置  20-22
    1.3.4 基于链交换的DNA分子机器的优缺点  22
  1.4 滚环复制  22-26
    1.4.1 滚环复制的概念  22-23
    1.4.2 滚环DNA扩增原理  23-24
    1.4.3 DNA滚环复制的应用  24-25
    1.4.4 RCA在基因检测及核酸研究方面的应用  25
    1.4.5 滚环DNA扩增的应用前景  25-26
  1.5 课题意义及主要研究内容  26-27
第二章基于哑铃型探针滚环-剪切-复制技术检测miRNA的研究  27-45
  2.1 引言  27-28
  2.2 实验部分  28-34
    2.2.1 主要试剂  28-31
    2.2.2 仪器装置  31
    2.2.3 哑铃型探针滚环-剪切-复制过程  31
    2.2.4 紫外-可见分光光度计检测试验样品  31-32
    2.2.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  32-33
    2.2.6 共聚焦荧光成像  33
    2.2.7 选择性实验  33-34
    2.2.8 实际样品的检测  34
  2.3 结果与讨论  34-44
    2.3.1 实验原理  34-36
    2.3.2 非变性聚丙烯酰胺电泳表征  36-37
    2.3.3 共聚焦荧光成像  37-38
    2.3.4 聚合酶用量对实验的影响  38-40
    2.3.5 剪切酶用量对实验的影响  40-41
    2.3.6 Let-a miRNA工作曲线的绘制以及肺细胞中let-a miRNA含量的检测  41-43
    2.3.7 let-7a miRNA检测的选择性的研究  43-44
  2.4 小结  44-45
第三章基于自组装DNA分子机器循环放大技术检测DNA、Ramos细胞、溶菌酶的研究  45-72
  3.1 引言  45-46
  3.2 实验部分  46-52
    3.2.1 主要试剂  46-48
    3.2.2 仪器装置  48
    3.2.3 反应时间对紫外吸光度的影响  48-49
    3.2.4 磁性微球对紫外吸光度的影响  49
    3.2.5 磁性微球表面结合DNA效率的研究  49
    3.2.6 DNA自组装构建DNA分子机器滚环放大检测靶DNA  49
    3.2.7 DNA自组装构建DNA分子机器检测Ramos细胞  49-50
    3.2.8 DNA自组装构建DNA分子机器检测溶菌酶  50-51
    3.2.9 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  51-52
  3.3 结果与讨论  52-71
    3.3.1 基于自组装DNA分子机器循环放大检测靶DNA  52-64
      3.3.1.1 实验原理  52-53
      3.3.1.2 非变性聚丙烯酰胺电泳表征  53-54
      3.3.1.3 H_2O_2-ABTS~(2-)紫外反应体系随反应时间紫外吸光度的变化  54-56
      3.3.1.4 磁性微球对H_2O_2-ABTS~(2-)紫外反应体系紫外吸光度的影响  56-57
      3.3.1.5 磁性微球表面结合DNA效率的研究  57-59
      3.3.1.6 聚合酶用量对实验的影响  59-60
      3.3.1.7 剪切酶用量对实验的影响  60-62
      3.3.1.8 DNA自组装构建DNA分子机器滚环放大检测靶DNA  62-64
      3.3.1.9 DNA自组装构建DNA分子机器滚环放大检测靶DNA的选择性  64
    3.3.2 DNA自组装构建DNA分子机器检测Ramos细胞  64-67
      3.3.2.1 DNA自组装构建DNA分子机器检测Ramos细胞的实验原理  64-65
      3.3.2.2 DNA自组装构建DNA分子机器检测Ramos细胞的灵敏度的研究  65-67
      3.3.2.3 DNA自组装构建DNA分子机器检测Ramos细胞的选择性的研究  67
    3.3.3 DNA自组装构建DNA分子机器检测溶菌酶  67-71
      3.3.3.1 DNA自组装构建DNA分子机器检测溶菌酶的实验原理  67-68
      3.3.3.2 DNA自组装构建DNA分子机器检测溶菌酶的灵敏度的研究  68-70
      3.3.3.3 DNA自组装构建DNA分子机器检测溶菌酶的选择性的研究  70-71
  3.4 小结  71-72
结论  72-73
参考文献  73-79
致谢  79-80
攻读学位期间发表学术论文目录  80-81

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