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外源性硫化氢对原代神经元APP代谢BACE-1/PS1的影响及其机制研究

作　者: 陈筱山
导　师: 晏勇
学　校: 重庆医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 外源性硫化氢神经元活力凋亡淀粉样前体蛋白 β位淀粉样前体蛋白裂解酶1 早老素1 磷脂酰肌醇-3 激酶丝裂原活化蛋白激酶
分类号: R749.16
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

第一部分：外源性硫化氢对原代培养皮层神经元活力和凋亡的影响目的：观察外源性硫化氢(H2S)对原代培养皮层神经元活力和凋亡的影响。方法：采用机械加酶消化法培养原代神经元，以硫氢化钠（NaHS)为外源性H2S的供体，分别以0、5、10、20、30、40、50、100和200μmol/L浓度NaHS干预培养的神经元，用甲氮甲唑蓝法（MTT）检测神经元活力；再分别以0、5、10、20、30、40、50和100μmol/L浓度NaHS干预神经元，用Hoechst33258法检测神经元凋亡。结果：成功培养神经元，其存活率95.1±2.3％，神经元纯度92.6±4.1％；NaHS浓度在5~20μmol/L时，神经元活力无明显改变，NaHS浓度在30μmol/L时，神经元活力降低；NaHS浓度40μmol/L~100μmol/L时神经元活力显著下降（P<0.05），200μmol/L浓度NaHS时，神经元活力进一步降低（P<0.01）。5~10μmol/L NaHS时神经元细胞核清晰，偶见少量浓缩，发白、发亮等凋亡细胞。20μmol/L浓度NaHS时，浓缩发亮细胞增加。30μmol/L NaHS起，神经元凋亡明显增加；40~50μmol/L浓度时，满视野可见多个凋亡细胞（P<0.05）；100μmol/L浓度NaHS时细胞核浓缩，变小，神经元数量减少（P<0.05）。结论：5~20μmol/L浓度NaHS时，神经元活力、凋亡无明显影响；而在大于30μmol/L NaHS时，神经元活力降低，凋亡增加。第二部分：外源性硫化氢对原代神经元淀粉样前体蛋白、β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老素1的影响目的：探讨外源性H2S对原代神经元淀粉样前体蛋白（Amyloidpeptide precursor，APP）、β位淀粉样前体蛋白裂解酶1（β-site APPcleaving enzyme1，BACE-1）和早老素1（Presenilin1，PS1）代谢的影响。方法：以原代神经元为研究对象，NaHS为外源性H2S供体，实验设对照组、NaHS5、10、20、30、40、50μmol/L组。按分组浓度分别处理原代神经元24h后,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Aβ1-42水平；荧光定量PCR方法检测BACE-1，PS1mRNA的表达；Western blot检测APP、BACE-1和PS1蛋白的表达。结果：5μmol/L浓度NaHS时，Aβ1-42表达水平降低，在10μmol/L和20μmol/L浓度NaHS时，Aβ1-42水平显著降低（P<0.05）；40~50μmol/L浓度NaHS时Aβ1-42水平升高。5μmol/L浓度NaHS起，BACE-1的mRNA表达水平降低，20~30μmol/L时，BACE-1mRNA水平显著降低（P<0.05）,40μmol/L、50μmol/L浓度时BACE-1mRNA水平增高；5μmol/L浓度NaHS起，PS1的mRNA表达水平降低，5μmol/L~30μmol/L浓度NaHS，PS1mRNA水平显著降低（P<0.05）,40μmol/L~50μmol/L浓度NaHS PS1mRNA升高。不同浓度NaHS作用于神经元后，各组APP蛋白表达无变化；5μmol/L~10μmol/LNaHS浓度时，神经元BACE-1蛋白表达水平降低；在20μmol/L NaHS时，BACE-1蛋白表达明显降低（P<0.05），40~50μmol/L NaHS时，BACE-1蛋白表达逐渐升高；10μmol/L和20μmol/L浓度NaHS时，PS1蛋白表达降低明显（P<0.05），40μmol/L和50μmol/L时，PS1表达增高。结论：外源性硫化氢在低浓度（NaHS在30μmol/L范围内）时，降低Aβ1-42水平，降低BACE-1和PS1mRNA表达水平，同时降低BACE-1和PS1蛋白表达水平；在大于40μmol/LNaHS浓度时，Aβ1-42水平，BACE-1和PS1mRNA和蛋白表达水平增加。提示用体外培养神经元为对象研究H2S作用和机制的实验研究所用NaHS的浓度以20μmol/L最佳。而不同NaHS浓度对APP蛋白的表达无影响。第三部分PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路在外源性硫化氢对原代神经元BACE-1/PS1影响中的作用目的：探讨PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路在H2S对神经元BACE-1/PS1影响的作用。方法：原代神经元为研究对象，添加PI3K/Akt和MAPK/ERK细胞信号通路抑制剂后检测BACE-1和PS1蛋白表达。以NaHS作为外源性H2S供体，分别设对照组、NaHS（20μmol/L）组、NaHS （20μmol/L）+PI3K通路阻断剂LY294002（20μmol/L）组，NaHS（20μmol/L）+MAPK通路阻断剂PD98059（20μmol/L）组，按分组浓度分别处理神经元24h, Western blot检测BACE-1和PS1蛋白表达。结果：在20μmol/L浓度NaHS干预后，神经元BACE-1蛋白表达明显降低（P<0.05）；PI3K阻断剂LY294002+NaHS共同干预后，BACE-1表达增加，与对照组无明显差异（P>0.05）。NaHS+PD98059组干预神经元后，BACE-1蛋白水平明显降低（P<0.05）。与NaHS+LY294002干预组相比，NaHS+PD98059组和NaHS组神经元BACE-1蛋白水平明显降低（P<0.05），而NaHS组和NaHS+PD98059组组间无差异（P>0.05）。20μmol/L浓度NaHS干预后，神经元PS1蛋白表达明显降低（P<0.05）；NaHS+PI3K阻断剂LY294002组，PS1表达无降低（P>0.05）。在NaHS+PD98059干预组，PS1蛋白水平明显降低（P<0.05）。与NaHS+LY294002干预组相比，在NaHS+PD98059组和NaHS组中， PS1蛋白水平明显降低（P<0.05）； NaHS组和NaHS+PD98059组组间PS1表达无差异（P>0.05）。结论：外源性硫化氢对原代神经元中BACE-1和PS1的代谢调控可能通过PI3K/Akt通路而非MAPK/ERK通路。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
中文摘要  7-11
ABSTRACT  11-16
前言  16-20
  参考文献  18-20
第一部分：外源性硫化氢对原代培养皮层神经元活力和凋亡的影响  20-35
  1 材料与方法  21-25
  2 结果  25-29
  3 讨论  29-31
  参考文献  31-35
第二部分外源性硫化氢对原代神经元 BACE-1 和 PS1 的影响  35-65
  1 材料与方法  36-52
  2 结果  52-59
  3 讨论  59-62
  参考文献  62-65
第三部分 PI3 K/Akt 和 MAPK/ERK 信号通路在外源性硫化氢对原代神经元BACE-1/PS1 影响中的作用  65-76
  1 材料与方法  65-67
  2 结果  67-71
  3 讨论  71-73
  参考文献  73-76
全文小结  76-77
文献综述  77-87
  参考文献  83-87
致谢  87-88
攻读博士学位期间发表的论文  88-89

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