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自噬和内质网应激相关蛋白在血管性认知障碍大鼠海马的表达及甲酯化脂氧素A₄的干预作用

作　者: 贾砚秋
导　师: 吕佩源
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 血管性认知功能障碍自噬慢性脑低灌注内质网应激甲酯化脂氧素A4
分类号: R749.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是临床上常见的一种病理状态，是血管性认知障碍（vascular cognitiveimpairment，VCI）的重要病因之一。目前已证实自噬及内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）机制参与了一些脑血管病理状态如缺血再灌注的损伤机制，而是否参与了CCH导致的细胞损伤尚无报道。本实验旨在对上述机制进行初探并观察甲酯化脂氧素A4（lipoxin A4methyl ester，LX A4ME）的干预作用。方法：以3月龄250-300g雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠为研究对象，首先完成侧脑室置管手术作为给药途径。1周后采用双侧颈总动脉结扎（bilateral common carotid artery ligation/two vessel occlusion,BCCAL/2VO）方式建立CCH动物模型。实验随机分为4组：假手术对照组，2VO模型组，LXA4ME低剂量治疗组（10ng/d）和LXA4ME高剂量治疗组（100ng/d）。术后通过微量注射套管给予假手术对照组生理盐水5μl/d、2VO模型组生理盐水5μl/d、LXA4ME低剂量组LXA4ME10ng/d及LXA4ME高剂量组100ng/d，连续给药14天。术后第15-20天进行行为学测试，包括定位航行实验（place navigationtest）和空间探索实验（spatial probe test），分别用于测定大鼠的空间学习能力和记忆能力。水迷宫测试结束后，采用HE染色观察各组大鼠海马的组织病理学变化；采用Western blot技术及RT-qPCR方法检测海马组织beclin1、LC3B、GRP78/Bip、CHOP蛋白及mRNA的表达水平，western blot方法检测p-mTOR及mTOR表达变化，常规RT-PCR检测sXBP-1mRNA表达水平。结果：1.水迷宫结果：1.1定位航行实验：逃避潜伏期随着训练天数逐渐缩短，2VO模型组大鼠与假手术组大鼠相比，从入水到找到平台的时间（潜伏期）明显延长（P<0.05）；LXA4ME治疗组较2VO模型组相比，潜伏期缩短（P<0.05）。1.2空间探索实验：与假手术对照组相比，2VO模型组大鼠在原平台所在象限停留时间所占比值降低（P<0.05），而LXA4ME治疗组在平台所在象限停留时间比例较2VO模型组有所增加（P<0.01）。2HE染色结果：假手术对照组大鼠海马CA1及CA3区锥体细胞排列紧密、均匀，结构完整，染色质分布均匀，细胞核大而圆，核仁清晰可辨，胞浆透明清亮；与假手术组相比，2VO模型组大鼠神经元排列疏松，部分锥体细胞出现核固缩，胞质呈强嗜酸性；LXA4ME治疗组海马锥体细胞神经元丢失明显减少，仍可见少量核固缩。3Western blot及PCR结果：3.1VCI大鼠海马自噬相关蛋白的表达：与假手术组对比，模型组p-mTOR及mTOR蛋白表达水平下降，前者具有统计学意义（P<0.01）。beclin1蛋白及mRNA表达水平均升高，其中蛋白表达具有统计学差异（P<0.05），mRNA变化无统计学差异（P>0.05）。LC3-II/LC3-I比值升高（P<0.01），mRNA表达增加，尚无统计学差异（P>0.05）。3.2LXA4ME对VCI大鼠海马自噬相关蛋白表达的影响：LXA4ME低剂量治疗组与模型组相比，p-mTOR及mTOR蛋白表达水平增加，前者具有统计学意义（P<0.05）。LXA4ME高剂量治疗组与模型组相比，p-mTOR及mTOR蛋白表达水平增加，前者具有统计学意义（P<0.01）。LXA4ME治疗组与模型组相比，beclin1蛋白及mRNA降低，前者具有统计学意义（P<0.05）。LXA4ME低剂量治疗组与模型组相比，LC3-II/LC3-I比值降低（P<0.05），mRNA表达稍高，无统计学差异（p0.05）。LXA4ME高剂量治疗组与模型组相比，LC3-II/LC3-I比值降低（P<0.01），mRNA表达降低，尚无统计学差异（P>0.05）。3.3VCI大鼠海马内质网应激相关蛋白的表达：与假手术组对比，模型组海马GRP78/Bip蛋白及mRNA表达水平略降低，无统计学差异（P>0.05）。CHOP蛋白及mRNA表达水平均升高，其中蛋白表达具有统计学差异（P<0.01），mRNA变化无统计学差异（P>0.05）。模型组sXBP-1mRNA表达无统计学差异（P>0.05）。3.4LXA4ME对VCI大鼠海马内质网应激相关蛋白表达的影响：LXA4ME低剂量治疗组与模型组相比，GRP78/Bip蛋白及mRNA、CHOP蛋白及mRNA以及sXBP-1mRNA表达水平无统计学差异（P>0.05）。LXA4ME高剂量治疗组与模型组相比，GRP78/Bip蛋白明显升高（P<0.01），mRNA变化无统计学差异。CHOP蛋白及mRNA均降低，其中蛋白表达具有统计学差异（P<0.01）。sXBP-1mRNA表达水平增加（P<0.01）。结论：ERS和自噬相关机制可能参与了CCH的致病过程。LXA4ME可有效改善CCH大鼠认知功能，提高其空间学习记忆能力，改善其海马区病理损伤。调节ERS和自噬相关蛋白可能是LXA4ME脑保护、改善认知功能的机制之一。

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-11
英文缩写  11-13
引言  13-15
第一部分甲酯化脂氧素 A_4对血管性认知障碍大鼠认知功能的影响  15-27
  前言  15
  材料与方法  15-19
  结果  19-20
  附图  20-22
  附表  22-23
  讨论  23-24
  小结  24
  参考文献  24-27
第二部分甲酯化脂氧素 A_4对血管性认知障碍大鼠海马组织病理学的影响  27-33
  前言  27
  材料与方法  27-29
  结果  29-30
  附图  30-31
  讨论  31
  小结  31
  参考文献  31-33
第三部分血管性认知障碍大鼠海马组织自噬相关蛋白的表达及甲酯化脂氧素 A_4的影响  33-49
  前言  33
  材料与方法  33-42
  结果  42-43
  附图  43-45
  附表  45-46
  讨论  46-47
  小结  47
  参考文献  47-49
第四部分血管性认知障碍大鼠海马组织内质网应激相关蛋白的表达及甲酯化脂氧素 A_4的影响  49-58
  前言  49
  材料与方法  49-51
  结果  51-52
  附图  52-54
  附表  54-56
  讨论  56-57
  小结  57
  参考文献  57-58
结论  58-59
综述内质网在神经细胞稳态中的作用  59-66
  参考文献  63-66
致谢  66-67
个人简历  67-68

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