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SAMP8小鼠海马神经元凋亡与线粒体融合蛋白Mfn1/Mfn2的表达及SS31肽的保护作用

作　者: 贾倩
导　师: 王建华；冯荣芳
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经病学
关键词: SS31 SAMP8小鼠阿尔茨海默病凋亡 BAX BCL2 MFN1 MFN2
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是以进行性记忆和认知功能下降为主要表现，伴有人格和行为异常的年龄相关的常见神经变性病。AD病人的病理改变主要有Aβ炎性斑、过度磷酸化的Tau蛋白形成神经原纤维缠结、线粒体/突触结构和功能改变及神经元减少。其发病机制有能量代谢假说、氧化应激假说、淀粉样蛋白（amyloid）级联反应假说、胆碱能假说等，但其具体机制尚未完全阐明。AD的发病率正逐年增长，给越来越多的AD病人及其家庭的生活、工作造成不便。目前最常用的AD模型为快速老化模型SAMP8模型。实验显示AD与氧化应激及线粒体功能异常有关。ROS主要在线粒体产生，并主要作用于线粒体，使线粒体数量减少，引起神经元一系列变化，促进细胞死亡。神经细胞组成成分被过度氧化时，调节凋亡的相关蛋白表达水平发生改变，促进凋亡的发生。对神经元的凋亡有调控作用的因子有：Caspase家族、线粒体融合基因和分裂基因表达及Bcl-2家族等。凋亡相关蛋白Bcl-2家族中Bcl-2能抑制凋亡，Bax能促进凋亡。Mfn1、Mfn2为线粒体融合基因。研究显示，融合基因表达在大多数严重的AD病人中下降较为明显，其中Mfn1下降最明显。融合基因表达减少使线粒体数量减少，ATP形成障碍，神经元变性，促进AD的发生。抗氧化剂的应用可抑制氧化应激，减轻线粒体结构破坏和功能障碍，减少细胞凋亡，改善AD病人的认知功能。SS31是一种抗氧化四肽，大多位于线粒体内膜。研究显示，它能减少线粒体活性氧产生、清除活性氧、抑制脂质等物质过氧化、抑制线粒体通透性改变、保护线粒体功能、减少细胞死亡，SS31对与细胞氧化损伤及线粒体功能障碍有关的各种神经变性病有效。目的：观察快速老化模型SAMP8(senescence-accelerated mouse prone8)小鼠和SAMR1(senescence accelerated mouse resistant1）小鼠海马神经元内融合蛋白Mfn1（Mitofusin1）和Mfn2（Mitofusin2）表达及凋亡相关蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma-2)和Bax (Bcl-2Assaciated X protein)表达情况；探讨线粒体靶向抗氧化肽SS31对中枢神经系统（Central nervoussystem CNS）是否有保护作用；并为抗衰老及AD的防治提供新的理论指导。方法：1实验动物及分组选取8月龄健康雄性SAMR1小鼠和SAMP8小鼠，将SAMP8小鼠随机分为三组，第一组不予干预为P8模型对照组（Model group），第二组注射生理盐水5mg/kg/d为溶媒对照组（Vehicle group），第三组腹腔注射SS315mg/kg/d为SS31处理组（SS31）。SAMR1小鼠注射生理盐水5mg/kg/d为R1正常对照组（Normal control group），实验动物共分为四组。2HE染色小鼠干预完毕后冰上断头取脑，于鼠脑视交叉至上丘之间的部位切取5um海马标本。应用HE染色技术染色，在光镜下四组小鼠海马CA1、CA3区病理学变化。3免疫组化小鼠干预完毕后冰上断头取脑，于鼠脑视交叉至上丘之间的部位切取5um海马标本。应用免疫组化技术，在光镜下观察四组小鼠海马CA1、CA3区内Bcl-2、Bax蛋白表达情况。4电镜技术小鼠干预完毕后冰上断头取脑，于鼠脑视交叉至上丘之间的部位分离出海马组织，切成1×1×1mm的组织块，用4%戊二醛固定，电镜技术检测。5蛋白印迹小鼠干预完毕后冰上断头取脑，将海马迅速分离出来，提取海马总蛋白，用Western Blot技术定量检测海马中Mfn1、Mfn2蛋白含量变化。结果：1HE染色SAMR1正常对照组海马CA1、CA3区神经元细胞边界、轮廓清晰，排列整齐、致密，核仁显示明显，胞核无固缩；P8模型对照组小鼠海马CA1、CA3区神经元细胞减少且杂乱，核仁显示不清楚、甚至消失，核固缩；SS31处理组小鼠海马CA1、CA3区细胞较溶媒对照组细胞边界、核仁稍清晰，胞核固缩、细胞数减少改善，但没有恢复到SAMR1正常对照组水平。2免疫组化2.1Bcl-2蛋白表达Bcl-2蛋白主要在海马CA1、CA3区神经元细胞胞浆表达，阳性细胞为浅黄色或黄褐色，背景染色较浅。P8模型对照组小鼠海马CA1、CA3区阳性神经元细胞较SAMR1正常对照组减少，SS31处理组小鼠海马CA1、CA3区阳性神经元细胞较溶媒对照组增多，但没有恢复到SAMR1正常对照组水平。阴性对照切片无阳性细胞。2.2Bax蛋白表达Bax蛋白主要在海马CA1、CA3区神经元细胞胞浆表达，阳性细胞为浅黄色或黄褐色，背景染色较浅。P8模型对照组小鼠海马CA1、CA3区阳性神经元细胞较SAMR1正常对照组增多，SS31处理组小鼠海马CA1、CA3区阳性神经元细胞较溶媒对照组减少，但没有恢复到SAMR1正常对照组水平。阴性对照切片无阳性细胞。3透射电镜SAMR1小鼠以正常神经元为主，很少见典型的凋亡细胞。SAMP8模型对照组小鼠海马组织细胞减少，排列杂乱。海马神经元凋亡样改变增多，胞浆内线粒体轻度肿胀，并出现较多空泡，部分仅见细胞轮廓。SS31处理组小鼠海马神经元较溶媒对照组细胞数量增多，神经元细胞、线粒体变化较轻，但没有恢复到SAMR1正常对照组水平。4蛋白印迹4.1Mfn1蛋白的表达与SAMR1正常对照组相比，P8模型对照组Mfn1蛋白表达降低(P＜0.05)；SS31处理组与溶媒对照组相比，Mfn1蛋白表达增高(P＜0.05)，但与SAMR1正常对照组相比仍降低(P＜0.05)。溶媒对照组和P8模型对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。4.2Mfn2蛋白的表达与SAMR1正常对照组相比，P8模型对照组Mfn2蛋白表达降低(P＜0.05)；SS31处理组与溶媒对照组相比，Mfn2蛋白表达增高(P＜0.05)，但与SAMR1正常对照组相比仍降低(P＜0.05)。溶媒对照组和P8模型对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：1在SAMP8小鼠中，海马神经细胞减少，细胞及线粒体形态异常，Bax蛋白表达增多，Bcl-2蛋白的表达降低。线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2表达降低。提示SAMP8小鼠中细胞凋亡增加，线粒体动力学失衡与神经细胞损伤有关。2在SS31干预下，海马神经细胞和线粒体异常有所恢复，海马神经细胞Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白的表达增多；线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2表达增多。提示SS31可改善线粒体分裂和融合失衡，减少细胞凋亡。

SAMP8小鼠海马神经元凋亡与线粒体融合蛋白Mfn1/Mfn2的表达及SS31肽的保护作用

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