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红景天苷对Aβ_1-40所致AD实验模型的干预作用及机制研究

作　者: 张振清
导　师: 柴锡庆
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 红景天苷阿尔兹海默病淀粉样蛋白氧化应激 P53 凋亡认知障碍线粒体凋亡
分类号: R749.16
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐袭且进行性发展的神经系统退行性疾病，临床上以进行性记忆障碍、失语、失用、失认、视空间损害、执行功能障碍及人格和行为改变为特征。AD的发病机制复杂，至今未有定论，目前人们提出几种假说，如胆碱能神经异常学说、淀粉样蛋白级联学说、自由基与凋亡学说、tau蛋白异常修饰学说、线粒体代谢障碍学说、兴奋性氨基酸毒性学说及基因突变学说等。但以上任何一种学说均不能完全阐明AD的发病机制。经过大量深入的研究，人们发现氧化应激、细胞凋亡、线粒体功能障碍与AD的发病有密切关系。AD的主要病理特征是大脑皮质弥漫性萎缩，大量的神经元丧失，细胞内神经纤维缠结和细胞外淀粉样斑块沉积，淀粉样斑块的主要成分是β-淀粉样蛋白（Aβ），它是从淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）由β-分泌酶和γ-分泌酶通过连续的蛋白水解裂解衍生的。研究表明，β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)在脑内的异常代谢、沉积是AD发病的核心环节，各种原因导致的Aβ生成和清除的代谢失衡，引起Aβ在脑组织中的异常积聚，进而触发了与AD病理生理、生化相关的级联反应。在Aβ的持续刺激下，脑实质内小胶质细胞活化、活性氧(reative oxygen species, ROS)生成增多。众多有害自由基的产生及凋亡因子活化，激活细胞凋亡途径，并诱导氧化应激损伤细胞，如DNA、蛋白质和脂类。然而，Aβ诱导的细胞凋亡具体的信号转导通路并没有被完全阐明。以上各个因素都直接或间接致使中枢神经系统受损。越来越多的研究证实，中枢神经细胞功能紊乱和凋亡可能由神经毒性所致，而这一神经毒性可能恰恰是由于Aβ沉积导致，从而导致痴呆的发生。由此推论脑内氧化应激、细胞凋亡在AD的发病机制中起重要作用，抗氧化、抗凋亡已成为防治AD重要方法之一。近年来大量研究已经证实AD发病与脑组织细胞凋亡有关。P53基因作为凋亡通路中的关键蛋白，与基因组的稳定性及细胞周期密切相关。正常情况下，P53基因在机体内环境的稳定和组织重建过程中发挥重要作用，过度表达和累积则会导致一系列的病理生理变化。免疫组织细胞学研究已证实AD大脑的老年斑内和神经纤维缠结中存在大量P53蛋白。那么，它在AD患者中枢神经组织细胞内的表达是否会随病程的延长而表达升高，增高的P53与AD患者的认知能力是否存在某种潜在联系，同时又是哪些因素促进其在患者体内过度表达，本文将就上述问题一一展开分析讨论。高原红景天属于景天科红景天属(Rhodiola)，广泛存在于我国高原地区，为我国传统藏药之一，对许多疾病都有独特功效。现代研究证实红景天具有较强的抗氧化损伤及清除氧化自由基的能力，可以促进细胞代谢及增强细胞活力。近几年来，红景天在提高脑细胞功能、增强记忆力方面的作用逐渐受到重视。我们课题组动物实验亦表明，红景天在痴呆相关疾病的治疗上可能具有潜在的应用前景。而红景天的主要有效单体成分红景天苷，能否对抗Aβ产生的中枢神经细胞损伤，能否可以改善Aβ所致的认知功能障碍以及通过哪种具体分子机制发挥作用至今尚无系统深入的研究。接受Aβ海马内注射的大鼠及接受Aβ刺激的SH-SY5Y细胞，是相对经典的AD动物模型和细胞模型，由于上述两种模型在体内体外较好地模拟AD的病理过程，与其他实验模型相比，更为切实的反应了AD的发病进程。本实验研究通过建立Aβ诱导的AD细胞及动物模型，从行为能力的改变、病理生理代谢产物的生成、生物酶学活性的变化、信号蛋白表达的激活及基因转录翻译调控等诸多层面，系统研究了红景天苷对Aβ1-40所致AD细胞及动物模型内在信号转导机制及认知功能障碍的干预作用。第一部分研究红景天苷对Aβ1-40导致的AD大鼠模型认知功能障碍的干预作用目的：体内实验部分，建立Aβ1-40诱导的AD大鼠模型，检测红景天苷对Aβ1-40所致AD大鼠认知功能障碍的干预作用。方法：大鼠海马内注射Aβ1-40制备AD模型，术后分别灌胃治疗，每日1次给予已定剂量、浓度的红景天苷(50mg·kg-1·d-1)，连续21天。自第17天开始，采用Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力，连续5天。数据以xˉ±s表示，用SPSS16.0统计分析软件进行数据处理并分析，组间资料应用重复测量方差分析，计数资料应用非参数秩和检验，以P<0.05判定为有显著性差异。结果：监测各组大鼠在Morris水迷宫测试实验中寻找到平台并爬上平台的寻台潜伏期。在测试的5天内所有大鼠的寻台潜伏期都表现为缩短趋势。AD模型组与假手术组相比，AD模型组寻台潜伏期明显延长(P＜0.05)，结果提示给予Aβ海马内注射后导致学习及记忆功能受损。红景天苷(50mg·kg-1·d-1)治疗组寻台潜伏期均值较模型组明显下降，与AD模型组相比明显缩短(P＜0.05)。自第五天的定位航行轨迹显示：假手术组大鼠游泳线路清晰、目标明确，能够在较短时间及距离内找到平台。海马内给予Aβ注射的大鼠寻找目标明显减弱，游泳路线无序、繁乱、盲目，需要经历较长距离及时间才能找到平台。而红景天苷治疗组大鼠找到平台前的游泳距离缩短，寻找目标的能力得以改善。监测撤去平台后各组大鼠在原平台象限活动时间与总时间比值及跨平台次数，与假手术组相比，AD模型组大鼠在原平台所处象限搜索时间所占比值明显降低(P＜0.05)，搜索能力测试中跨过原平台所在位置的次数也显著减少(P＜0.05)，红景天苷治疗组(50mg·kg-1·d-1)在原平台所在象限搜索时间所占比值及跨平台次数均较模型组显著升高和增加(P＜0.05)，但未恢复至正常水平。结论：在接受Aβ1-40双侧海马内注射的大鼠，其记忆学习能力显著下降，给予已定量红景天苷治疗的AD大鼠，学习记忆能力的下降逆转。说明课题组已成功建立Aβ1-40双侧海马内注射所诱导的AD实验大鼠模型。提示红景天苷对Aβ1-40诱导的AD实验模型大鼠认知功能障碍具有显著改善作用。第二部分红景天苷对Aβ1-40所致AD模型大鼠氧化应激及凋亡的影响目的：氧化应激反应是不同刺激因素所诱发神经细胞损伤及多种中枢神经功能退行性紊乱疾病的共同通路。Aβ1-40能通过不同途径激发脑组织细胞内的氧化应激反应，进而产生大量ROS。本部分实验研究通过检测红景天苷对Aβ1-40所导致AD实验模型大鼠海马组织细胞内总ROS生成、血清及海马组织细胞内SOD活性、血清及海马组织细胞内MDA含量来深入研究探讨红景天苷对Aβ1-40所致AD模型大鼠脑内氧化应激损伤的影响。方法：Aβ1-40海马内注射制备AD实验大鼠模型，术后给予已定量红景天苷(50mg·kg-1·d-1)灌胃治疗，每日1次共21天。建立模型成功后，采用DCFH-DA作为荧光检测探针，采用流式细胞技术测定AD实验模型大鼠海马组织细胞内总ROS生成，氧化酶法测定AD大鼠模型血清及海马组织细胞内SOD活性，采用硫代巴比妥酸法检测大鼠血清及海马组织细胞内MDA的含量。数据用ˉx±s表示，用SPSS16.0统计分析软件进行统计学数据分析，用方差分析及LSD进行组间比较和两组间比较，以P<0.05为有显著性差异。结果：（1）本部分实验研究采用流式细胞技术（FCM）检测各组大鼠海马组织细胞的ROS含量。与假手术组相比，AD模型组大鼠海马组织细胞内ROS含量明显增加(P＜0.05)。给予红景天苷（50mg·kg-1·d-1）治疗21天后，AD模型大鼠海马组织细胞内总ROS含量受到显著抑制(P＜0.05)，虽然未回到正常水平，但与假手术组相比(P＞0.05)。（2）按实验要求测定AD模型大鼠血清SOD活性。与假手术组相比，AD模型组大鼠血清内SOD活性显著降低(P＜0.05)，给予红景天苷（50mg·kg-1·d-1）治疗21天后，大鼠血清SOD活性较AD模型组显著升高(P＜0.05)，虽然未回到正常水平，但与假手术组相比(P＞0.05)，海马组织细胞内SOD活性检测结果与血清学检测结果趋势相同。（3）与假手术组相比，AD模型组大鼠血清MDA含量显著升高(P＜0.05)，给予红景天苷（50mg·kg-1·d-1）治疗21天后，血清MDA含量较AD模型组显著降低(P＜0.05)，虽然未回到正常水平，但与假手术组相比(P＞0.05)，海马组织细胞内MDA含量检测结果与血清学检测结果趋势相同。(4)实验研究通过检测AD实验模型大鼠海马组织细胞的凋亡情况。与假手术组相比，AD模型组大鼠海马组织细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)，给予红景天苷（50mg·kg-1·d-1）治疗21天后，实验结果证实经药物干预治疗，AD模型大鼠海马组织细胞凋亡较AD模型组显著降低(P＜0.05)，但与假手术组相比(P＞0.05)，仍未回到正常水平，结论：红景天苷可能通过有效抑制Aβ1-40所导致的AD大鼠模型海马组织细胞内的总ROS生成、同时提高血清及海马组织细胞内SOD活性并减少血清及海马组织细胞内MDA含量，从局部和整体双向验证红景天苷可以提高AD模型大鼠的抗氧化应激能力并减轻神经细胞因氧化应激所造成的损伤。第三部分红景天苷对Aβ1-40所致AD模型大鼠海马NADPH氧化酶-ROS通路的影响目的：NADPH氧化酶是组织细胞内ROS产物的主要来源。本部分实验通过观察NADPH氧化酶家族成员亚基的的表达与激活，对红景天苷是否可以抑制AD模型大鼠海马组织细胞内ROS产生的上游通路的潜在机制进行探讨。方法：采用Aβ1-40海马内注射制备AD大鼠模型,术后给予已定量的红景天苷(50mg·kg-1·d-1)灌胃治疗，每日1次共21天。建立模型成功后，采用RT-PCR技术和Western blot技术检测大鼠海马组织中gp91phox及其他亚基在mRNA和蛋白水平的表达。数据用ˉx±s表示，用SPSS16.0统计分析软件进行统计学数据分析，采用方差分析及LSD进行组间比较及两组间比较，以P<0.05为有统计学差异。结果：(1) Western Blot结果显示，Aβ1-40可导致AD模型大鼠海马组织细胞内p22phox、p67phox、gp9lphox及p47phox蛋白表达明显升高。AD模型组上述各蛋白的含量分别是假手术组的2.16、2.57、3.02及2.71倍(P＜0.05)。而给予已定量红景天苷干预治疗后，大鼠海马组织p22phox、p67phox、gp9lphox及p47phox蛋白表达较AD模型组分别降低了24.1%、26.3%、31.1%及34.2%(P＜0.05)。(2) RT-PCR检测。研究结果显示，与假手术组相比，AD模型组大鼠海马组织细胞内p22phox、p67phox、gp9lphox及p47phoxmRNA表达显著升高。AD模型组较假手术组mRNA水平分别升高了84.1%、96.3%、101.1%及104.2%(P＜0.05)。而给予已定量红景天苷干预治疗后，能够显著抑制Aβ1-40的这种诱导效应。红景天苷干预组较AD模型组分别降低了34.3%、36.1%、33.4%及30.1%(P＜0.01)。结论：红景天苷可抑制NADPH氧化酶家族成员的亚基进而抑制ROS的产生，此过程可能是通过抑制其家族成员亚基的表达和抑制其亚基激活来实现，或者是两个作用相互协同作用来抑制NADPH氧化酶活化。红景天苷通过对NADPH氧化酶-ROS通路的有效抑制，明显减轻了Aβ1-40所诱导的AD实验模型大鼠脑组织细胞内氧化应激反应。第四部分红景天苷对Aβ1-40所致AD模型大鼠海马ROS-P53线粒体凋亡通路的影响目的：为了进一步明确ROS导致细胞凋亡率增加的具体机制，我们检测了ROS生成后可能导致细胞凋亡的相关蛋白P53的表达。同时验证在P53基因基础上红景天苷对Bcl-2、Bax及线粒体凋亡通路的影响方法：采用Aβ1-40海马内注射制备AD大鼠模型,术后给予已定量的红景天苷(50mg·kg-1·d-1)灌胃治疗，每日1次共21天。建立模型成功后，采用Western-blot检测AD模型大鼠海马组织细胞中细胞凋亡的相关蛋白P53的表达。同时验证在P53基因基础上红景天苷对Bcl-2、Bax及线粒体凋亡通路蛋白的表达，数据用ˉx±s表示，用SPSS16.0统计分析软件进行统计学数据分析，采用方差分析及LSD进行组间比较及两组间比较，以P<0.05为有统计学差异。结果：(1) Western Blot结果显示，Aβ1-40可致使AD模型大鼠海马组织细胞核内P53表达，并使其表达显著升高。AD模型组最高细胞核内P53蛋白的含量可达假手术组的5-6倍(P＜0.05)。而给予已定量红景天苷干预治疗后，AD模型大鼠海马组织细胞核内P53蛋白表达与AD模型组相比降低近50%(P＜0.05)。(2)与假手术组相比，AD实验模型组大鼠海马组织细胞Bax表达显著升高；而AD实验模型组大鼠海马组织细胞Bcl-2的表达明显下调。AD实验模型组较假手术组Bax升高151%(P＜0.05)；AD实验模型组较假手术组Bcl-2下调近70%(P＜0.05)。而给予已定量红景天苷干预治疗后，能够显著抑制Aβ1-40的上述诱导效应。Bax及Bcl-2在红景天苷干预组较AD模型组分别降低和升高了40%及55%(P＜0.05)。(3)与假手术组相比，AD实验模型组大鼠海马组织细胞内Caspase-9及Caspase-3表达显著升高；AD实验模型组较假手术组Caspase-9及Caspase-3升高151%及124%(P＜0.05)，在给予已定量红景天苷干预治疗后，能够显著抑制Aβ1-40的上述诱导效应。Caspase-9及Caspase-3在红景天苷干预组较AD模型组分别降低了40%及55%(P＜0.05)。结论：红景天苷抑制NADPH氧化酶产生ROS进而抑制P53入核活化从而抑制caspase-9和caspase-3表达，说明红景天苷通过对NADPH氧化酶-ROS-P53-线粒体凋亡途径抑制，减轻了Aβ1-40诱导的AD脑组织细胞内氧化应激及凋亡的发生。第五部分红景天苷通过PI3K/Akt/Nrf-2/HO-1信号通路减少P53在细胞核内的表达抑制细胞凋亡目的：探讨红景天苷保护神经细胞防止β-淀粉样蛋白损伤的机制。从而为海马内注射β-淀粉样蛋白诱导的AD模型提供了有力的证据。因为接受β-淀粉样蛋白刺激的SH-SY5Y细胞和海马内注射β-淀粉样蛋白大鼠是经典的AD细胞及动物模型，已被广泛用于研究。所以我们研究发现，红景天苷在体外实验中能有效防止SH-SY5Y细胞由于β淀粉样蛋白所诱导的细胞凋亡，从而保护神经细胞免受氧化损伤，其机制可能是通过上调HO-1的表达，降低神经细胞P53的核表达来实现。来逆转β-淀粉样蛋白诱导的神经细胞P53的核表达实现。方法：Western blot检测蛋白表达；总蛋白（30μg）对每个样品用10%SDS-PAGE分离，并PVDF膜转移过夜，和抗体的特异性结合前采用5%脱脂奶粉或BSA的磷酸盐缓冲盐水封闭。然后检测HO-1、P53、Akt蛋白和Bax、Bcl-2蛋白，活性状态的caspase-9/3或Nrf-2抗体（1:1000）4℃过夜。洗涤三次后，用磷酸盐缓冲盐水（0.1%Tween-20的pH7.4）中和，ARE-荧光素酶活性测定法：SH-SY5Y细胞接种于6孔板中以1×105cells/ml的密度，孵育过夜。在每个样品中，荧光素酶报告质粒构建携带该ARE启动子和β-半乳糖苷酶的表达载体质粒2μg，使用转染试剂以每加入10μl2μg的DNA的比例共转染。根据由制造商提供的方法测定。简而言之，将细胞用冷PBS洗涤，并收获被动裂解缓冲液中。离心后，用于测定荧光素酶活性，取上清液20μl由光度计测定。TUNEL染色：末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法在SH-SY5Y细胞被用来通过检查DNA片段化处理之后的细胞，以评估细胞死亡。简言之，将细胞培养于6孔细胞培养板并如上所述进行处理。处理后，将细胞用PBS洗涤，然后沉淀到显微镜载玻片。残余的PBS中，然后取出，并用95%乙醇固定细胞。用4%不含甲醇的甲醛的PBS中进行第二次的固定。载玻片再次用PBS洗涤，并通过加入荧光素12-dUTP标记的DNA中的带切口端部在凋亡细胞中检测到片段化DNA。玻片在37℃温育1小时，并终止反应用2×SSC。将载玻片在PBS中洗涤，然后用荧光显微镜在400×可视化，和绿色的荧光率与DNA片段化。实验分别分三次重复完成，并TUNEL阳性细胞的百分比进行测定。数据用xˉ±s表示，用SPSS16.0统计分析软件进行统计学数据分析，采用方差分析及LSD进行组间比较及两组间比较，以P<0.05为有统计学差异。结果：(1) Aβ1-40可显著降低细胞活力而红景天苷可逆转此现象，(2)红景天苷提高细胞存活率这一现象可被ZnPPIX所抑制。由此表明红景天苷对HO-1的诱导性表达和增加细胞生存能力起着关键性作用，(3)红景天苷通过Nrf-2的激活诱导HO-1表达，同时红景天苷抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，而P53活化剂-RITA可以诱导细胞凋亡。结论：P53蛋白直接诱导细胞凋亡，从而加重认知功能障碍。因此，P53可视为氧化应激在AD的早期标志。我们发现，在AD脑组织及细胞实验中，红景天苷可激活PI3k/AKT途径激活Nrf-2及HO-1表达，从而著降低P53的核表达，从而抑制细胞凋亡及认知功能障碍的发生。

全文目录

摘要  5-13
ABSTRACT  13-23
英文缩写  23-25
引言  25-27
第一部分红景天苷对 Aβ_(1-40)所致 AD 模型大鼠认知障碍的干预作用  27-43
  前言  27-28
  材料与方法  28-30
  结果  30-31
  附图  31-34
  讨论  34-37
  小结  37
  参考文献  37-43
第二部分红景天苷对 Aβ_(1-40)所致 AD 模型大鼠氧化应激及凋亡的影响  43-66
  前言  43-44
  材料与方法  44-52
  结果  52-54
  附图  54-57
  附表  57-59
  讨论  59-62
  小结  62
  参考文献  62-66
第三部分红景天苷对 Aβ_(1-40)所致 AD 模型大鼠海马组织细胞 NADPH氧化酶-ROS 通路的影响  66-84
  前言  66-67
  材料与方法  67-73
  结果  73-75
  附图  75-79
  讨论  79-81
  小结  81
  参考文献  81-84
第四部分红景天苷对 Aβ_(1-40)所致 AD 模型大鼠海马 ROS-P53 线粒体凋亡通路的影响  84-99
  前言  84-85
  材料与方法  85-88
  结果  88-90
  附图  90-93
  讨论  93-95
  小结  95
  参考文献  95-99
第五部分红景天苷通过 PI3K/Akt/Nrf-2/HO-1 信号通路减少 P53 在细胞核内的表达抑制细胞凋亡  99-119
  前言  99-100
  材料和方法  100-102
  结果  102-104
  附图  104-111
  讨论  111-113
  小结  113
  参考文献  113-119
结论  119-120
综述线粒体功能障碍在阿尔茨海默病发病中的作用  120-135
  参考文献  126-135
致谢  135-136
个人简历  136-137

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