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地黄饮子介导SDF-1/CXCR4信号通路促脑缺血后内源性神经干细胞移行的研究

作　者: 范文涛
导　师: 刘柏炎
学　校: 湖南中医药大学
专　业: 中医内科学
关键词: 地黄饮子 SDF-1 CXCR4 脑缺血内源性神经干细胞移行
分类号: R743.31
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：本研究从整体、分子及细胞水平观察脑缺血后SDF-1/CXCR4信号通路对内源性神经干细胞移行的影响及地黄饮子的作用机制。通过观察地黄饮子对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞迁移及SDF-1/CXCR4的影响,明确SDF-1/CXCR4信号通路促进内源性神经干细胞移行的作用机制。阐明SDF-1/CXCR4信号通路对神经再生的作用和地黄饮子促神经再生的机制,揭示缺血性脑卒中神经再生新的调节机制和作用靶点。方法：实验一：地黄饮子对大鼠局灶性脑缺血后SDF-1蛋白含量的影响。采用大脑中动脉线栓法复制脑缺血模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、地黄饮子高剂量组、地黄饮子中剂量组、地黄饮子低剂量组、尼莫地平组,每组15只。另设伪手术组15只,手术只分离右侧颈动脉,不栓塞,后逐层缝合,术后青霉素腹腔注射预防感染3天。空白组正常饮食、光照。给药：地黄饮子高剂量组灌服地黄饮子汤120g·kg,地黄饮子高剂量组灌服地黄饮子汤36g·kg,地黄饮子高剂量组灌服地黄饮子汤12g·kg,连续3周。尼莫地平组大鼠每天灌服尼莫地平,将尼莫地平溶解于注射用水中,剂量为12.5mg/kg,疗程为3周。模型组灌服普通自来水,自由饮食,连续3周。进行行为学评分,测量脑梗死面积,免疫组化染色,检测SDF-1蛋白含量检测。实验二：地黄饮子含药血清对海马脑片SDF-1的影响。采用大脑中动脉线拴法复制脑缺血模型。造模成功后灌服地黄饮子药液每次2mL,剂量换算方法按照体表面积相当于正常成年人70Kg体重剂量的3倍,换算为大鼠的用药剂量约为每公斤体重灌服生药量14.5克。治疗第7天给药后断头处死动物,收集大鼠的血液,离心分离血清,放入温度为56℃水浴中灭活30分钟,采用0.22μm滤器进行过滤,分装并放置于-20℃的冰箱中备用。用乙醚麻醉大鼠,至于无菌环境,断头取出脑组织,放入含糖浓度为7.5g/L的HBSS溶液中,温度保持在4℃,分理处海马组织。放在表面铺有3%琼脂的活组织切片机上,采用冠状面切开脑组织,切成厚度约400μm的脑片。再将脑片放入6孔培养板的微孔滤膜上,培养板浸泡在培养液中。每个培养板含有6孔,每孔放置脑片6张,培养液含有5%CO2,温度为37℃。将培养板放入平衡湿度的标准培养箱进行培养,隔日更换培养液,培养时间为2周。培养分组：培养2周后,分为对照组(HOTC组)和低氧缺糖组(OGD组)。采用的培养液成分：25%HBSS、50%MEM、23%马血清、0.75%葡萄糖、0.5%谷氨酰胺、2%双抗。实验中取两组脑片,分别是HOTC组、OGD组,两组脑片按照每100mg的脑片分别加入1ml的匀浆液并充分搅拌匀浆,在温度4℃离心机以12000转/分钟,离心10分钟,取上清液并进行分装,存入-80℃的冰箱中备用。按Lowry et al的方法,采用小牛血清蛋白做为标准参考蛋白,进一步测定蛋白含量。实验三：地黄饮子含药血清对胎鼠海马神经干细胞迁移的影响。实验采用出生15天的胎鼠,断头后取出脑组织,使用单克隆方法及限稀释法培养神经干细胞,采用DMEM/F12细胞培养基。加入B27添加剂20m1.L-1,加入bFGF10g.L-1、EGF20g. L-1。等神经细胞生长出现神经细胞团时,采用机械吹打的方式反复吹打,吹打后进行细胞传代培养,每2-3天传代1次。然后进行神经干细胞培养。细胞培养实验共分为3组,包括治疗组、模型组、空白组。治疗组细胞培养时给予地黄饮子含药血清；模型组细胞培养给予等量0.01mol/LPBS条件培养液;空白组细胞给予正常细胞培养。各组培养液均于低糖培养损伤2小时后再加入,培养液浓度为15%,分别进行5次实验。各组细胞经低糖损伤2小时后放入温度为37℃,含有5%C02培养箱中进行培养,时间为24小时。收集所有培养孔中的克隆细胞,加入甲醇固定15分钟,再离心后去上清液,加入0.5mL0.01mol/LPBS吹打均匀,移取少量细胞放置于细胞计数板上,在显微镜下用10倍物镜观察并计数,统计细胞数大于50个的克隆数。将培养好的神经干细胞接种在transwell小室上层,在小室上层表面贴上趋化滤膜,将细胞培养液放在transwell小室上层,在培养箱中孵育8小时,用甲醇固定趋化滤膜背面的神经干细胞,染色后在显微镜下计数,并计算迁移指数：条件为计算每10个高倍视野下细胞数用于计算细胞迁移指数。结果：(1)大鼠行为学评分：Longa评分是对大鼠神经系统损伤程度进行评估,在实验第7天、第14天、第21天分别进行神经功能评分。空白组大鼠神经功能正常,地黄饮子高剂量组和中剂量组在实验第7天、第14天与模型组比较有显著差异(P<0.05);在第21天,与模型组比较有非常显著差异(P<0.01)。地黄饮子低剂量组与尼莫地平组比较无显著性差异。(2)脑梗死面积测定：空白组大鼠脑梗死面积为0,地黄饮子高剂量组和中剂量组与模型组比较有非常显著差异(P<0.01),地黄饮子低剂量组与模型组比较差异具有显著性(P<0.05),尼莫地平组与模型组比较无显著性差异。(3)脑缺血大鼠BrdU阳性细胞数量变化：对大鼠BrdU阳性细胞的数量相比,CA1区和CA3区、DG区,地黄饮子高剂量组与模型组比较,差异有非常显著性(P<0.01)。地黄饮子中剂量组、地黄饮子低剂量组与模型组比较有显著差异(P<0.05)；尼莫地平组与模型组比较无显著性差异。(4)脑缺血大鼠SDF-1蛋白含量的影响：各组大鼠脑内SDF-1蛋白含量测定,地黄饮子高剂量组和中剂量组与模型组比较有非常显著差异(P<0.01),地黄饮子低剂量组与模型组比较差异具有显著性(P<0.05),尼莫地平组与模型组比较无显著性差异。(5)大鼠海马脑片SDF的变化：各组大鼠脑片SDF-1蛋白、CXCR4含量测定,地黄饮子含药血清培养大鼠脑片,能明显提高缺血、缺氧组脑片SDF-1蛋白、CXCR4含量,与对照组相比差异有显著性意义的(P<0.05)。(6) Western blot检测各组SDF-1蛋白含量,OGD组经地黄饮子含药血清培养明显提高SDF-1蛋白含量,优于对照组(IOTC组)。(7)神经细胞移行变化：正常培养的神经干细胞,在细胞贴壁后周围都会聚集大量细胞,细胞之间的距离小于0.5mm,低糖、低氧损伤导致细胞间距缩小。地黄饮子含药血清干预后神经干细胞出现迁移现象,细胞间距增大,迁移距离为1.8-2.1mm。(8)海马神经干细胞细胞克隆计数的影响：地黄饮子含药血清在第3天、第7天神经干细胞克隆数与模型组比较具有显著性差异(P<0.05),在第1天与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。(9)海马神经干细胞细胞移行的影响：实验采用Transwell法观察神经干细胞迁移情况,治疗组经Transwell小室迁移后染色计数,迁移细胞数数量明显高于模型组,结果表明地黄饮子含药血清能明显促进神经干细胞迁移。结论：(1)地黄饮子能有效改善脑缺血后大鼠神经功能缺损。大剂量组和中剂量组疗效优于低剂量组和尼莫地平组。(2)地黄饮子高剂量组和中剂量组能提高SDF-1蛋白含量,疗效优于尼莫地平组,表明地黄饮子能明显促进内源性神经再生。SDF-1含量的提高够助于促进脑缺血后神经干细胞迁移至缺血区,进一步分化为神经元。(3)地黄饮子能促进脑缺血后大鼠神经功能恢复,减轻脑水肿,减少脑梗死面积。促进SDF-1蛋白含量的升高,通过SDF-1/CXCR4信号通路进一步促进海马区神经干细胞增殖,并迁移至缺血损伤区域分化成神经元,修复缺血区损伤。(4)地黄饮子含药血清能有效提高缺血缺氧区脑片SDF-1含量,进一步改善脑组织缺血缺氧能力,通过SDF-1/CXCR4信号通路促进脑组织神经再生能力,进一步促进低氧低糖区脑组织神经再生能力。(5)地黄饮子含药血清能促进大鼠海马神经干细胞克隆计数,促进神经干细胞迁移数及迁移率,促进神经干细胞迁移至缺血区,分化为神经元,这可能是地黄饮子促神经再生的机制之一。

全文目录

英文缩写词表  8-9
中文摘要  9-14
ABSTRACT  14-22
引言  22-27
第一部分地黄饮子对大鼠局灶性脑缺血后SDF-1蛋白含量的影响  27-43
  1.实验材料  28-30
    1.1 动物  29
    1.2 药物  29
    1.3 主要试剂  29-30
    1.4 仪器  30
  2.实验方法  30-34
    2.1 动物造模  30-31
    2.2 动物分组与给药  31
    2.3 行为学评分  31-33
      2.3.1 Longa评分：神经行为学检查  31-32
      2.3.2 Berderson评分：姿势反射测验  32-33
    2.4 测量脑梗死面积  33
    2.5 组织处理  33
    2.6 免疫组化染色  33
    2.7 SDF-1蛋白含量检测  33-34
    2.8 统计分析  34
  3.结果与分析  34-38
    3.1 地黄饮子对脑缺血大鼠Longa评分的影响  34
    3.2 地黄饮子对脑缺血大鼠Berderson评分的影响  34-35
    3.3 地黄饮子对脑缺血大鼠脑梗死面积的影响  35
    3.4 地黄饮子对BrdU阳性细胞数量的影响  35-36
    3.5 地黄饮子对脑缺血大鼠SDF-1蛋白含量影响  36-37
    3.6 各组大鼠海马SDF-1的变化  37-38
  4.讨论  38-42
    4.1 神经干细胞与脑缺血损伤  38-40
    4.2 神经干细胞与神经再生  40-42
  5.结论  42-43
第二部分地黄饮子含药血清对海马脑片SDF-1的影响  43-54
  1.实验材料  43-44
    1.1 动物  43
    1.2 药物  43
    1.3 主要试剂  43-44
    1.4 仪器  44
  2.实验方法  44-47
    2.1 地黄饮子含药血清制备  44-45
    2.2 海马脑片培养  45
    2.3 分组  45
    2.4 地黄饮子含药血清海马脑片培养  45-46
    2.5 组织切片制备  46
    2.6 免疫组化染色(ABC法)  46
    2.7 Western blot检测  46-47
    2.8 图像及数据的统计处理  47
  3.结果与分析  47-48
    3.1 检测HOTC组、OGD组大鼠海马脑片SDF-1/CXCR4变化  47
    3.2 大鼠脑片海马区SDF-1的变化  47-48
    3.3 Western blot检测各组SDF-1蛋白含量变化  48
  4.讨论  48-53
    4.1 神经干细胞迁移与SDF-1/CXCR4信号通路  48-50
    4.2 SDF-1与内源性神经细胞再生  50-51
    4.3 补肾填髓中药促内源性神经干细胞再生  51-53
      4.3.1 整体研究  51
      4.3.2 体外研究  51-53
  5.结论  53-54
第三部分地黄饮子含药血清对胎鼠海马神经干细胞迁移的影响  54-68
  1.实验材料  54-55
    1.1 动物  54
    1.2 药物  54
    1.3 主要试剂  54-55
    1.4 仪器  55
  2.实验方法  55-58
    2.1 局灶性脑缺血动物模型复制  55-56
    2.2 NSCS细胞培养与传代  56
    2.3 细胞接种  56-57
    2.4 含药血清的制备  57
    2.5 实验分组与给药  57
    2.6 细胞克隆计数  57-58
    2.7 神经干细胞移行(Transwell法)  58
    2.8 图像及数据的统计处理  58
  3.结果与分析  58-61
    3.1 神经细胞移行变化  58
    3.2 地黄饮子含药血清对海马神经干细胞细胞克隆计数影响  58-59
    3.3 神经细胞不同时期增殖分化  59
    3.4 地黄饮子含药血清对海马神经干细胞细胞移行的影响  59-60
    3.5 各组神经干细胞迁移比较  60-61
  4.讨论  61-67
    4.1 内源性神经干细胞迁移的影响因素  61-64
    4.2 肾与脑相关的理论渊源  64-65
    4.3 地黄饮子研究进展  65-66
    4.4 地黄饮子促神经干细胞迁移的机制  66-67
  5.结论  67-68
结论  68-69
致谢  69-70
主要创新点  70-71
  1、新的研究思路  70
  2、新的作用机制  70
  3、新的作用靶点  70-71
参考文献  71-77
附录  77-80
文献综述  80-102
  参考文献  96-102
攻读学位期间主要的研究成果目录  102-103

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