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神经退行性疾病病理及潜在治疗药物研究

作　者: 张琳
导　师: 周飞艨
学　校: 中南大学
专　业: 化学工程与技术
关键词: 阿尔茨海默病 帕金森病 铜离子 多巴胺 抑制剂 药物筛选 天然药物
分类号: R741
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


神经退行性疾病是全球老年人中发病率较高的疾病之一。阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)和帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)是两种最常见的神经退行性疾病,病患大多伴随着大脑皮质萎缩、神经元丧失、蛋白质堆积以及金属离子的过量堆积等临床病理特征。近年来的研究表明：异常聚集的蛋白质和金属离子(如Cu2+、Fe3+)引起的氧化应激效应可能是导致AD和PD的主要原因。蛋白质错误折叠形成的聚集物(如可溶性的寡聚体、纤维等)可以破坏细胞膜,导致神经元凋亡；具有氧化还原活性的金属离子(如Cu2+、 Fe3+)催化产生的活性氧物质可以削弱线粒体的生理功能、破坏神经细胞膜,导致神经元凋亡。基于蛋白质和金属离子的异常聚集在AD和PD中的重要意义,本论文深入研究了金属离子在脑内异常堆积的化学机理,探索了金属离子催化氧化产物的在线检测方法,以及治疗神经退行性疾病的潜在药物与错误折叠的蛋白质聚集体之间的相互作用。具体工作包括：(1)Cu2+在AD病人脑中的老年斑中大量堆积是AD病的重要病理学特征,但是导致Cu2+过量堆积的原因并不清楚。本研究利用β-淀粉样多肽(amyloid beta peptide, A(3)的变异多肽Aβ(1-16)(Y10W)(色氨酸代替Aβ(1-16)中10位的酪氨酸)作为荧光探针实时监测Cu2+在Aβ(1-16)(Y10W)与Aβ(1-42)之间的分配比例,发现Aβ聚集态与Cu2+的络合能力比Aβ单体高两个数量级。电子顺磁共振结果进一步证实了Aβ(1-42)的聚集态比单体具有更强的络合Cu2+的能力,甚至可以夺取人血清蛋白中络合的Cu2+。造成聚集态Aβ(1-42)络合Cu2+能力增强的原因可能是：形成聚集物后,相邻的两个Aβ(1-42)分子间的三个组氨酸协同参与了Cu2+的络合,使Aβ(1-42)与Cu2+的络合更加稳定。Aβ(1-42)聚集物比其单体具有更强的Cu2+的络合能力,合理的解释了老年斑中Cu2+异常堆积的疑问。(2)人体多巴胺(dopamine, DA)水平与PD密切相关。DA易氧化生成多种有神经细胞毒性的中间产物,Fe3+能大大加快DA的氧化速率。六羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)是一种极易被氧化且具有神经细胞毒性的DA氧化中间产物。但是,由于6-OHDA极不稳定,常规检测方法很难实现其在线检测。本研究利用反相离子对色谱与电子喷雾质谱联用技术,实现了对Fe3+催化DA氧化的4种重要产物及中间产物(包括6-OHDA)的在线检测。该技术为研究Fe3+催化DA氧化的反应机理提供了技术支持。(3)与Aβ自聚集片段有着相似序列的多肽(β-折叠阻断肽)可以有效抑制Aβ聚集并降低Aβ聚集物引起的神经细胞毒性。本研究利用二茂铁(ferrocene, Fc)标记的水溶性的β-折叠阻断肽(KLVFFK6),采用电化学方法研究了其对Aβ(1-42)聚集行为的抑制作用。研究发现Fc-KLVFFK6可与Aβ(1-42)的聚集物结合从而达到抑制Aβ(1-42)聚集的效果；低于化学计量比浓度的Fc-KLVFFK6可以有效的抑制Aβ(1-42)寡聚体和纤维的形成,并有效抑制Aβ(1-42)聚集物引起的神经细胞毒性。Fc-KLVFFK6与Aβ(1-42)的作用过程遵循准一级反应,反应速率为1.89±0.05×10-4s-1。(4)部分天然产物的提取物可以有效抑制Aβ聚集物的产生,但在众多的天然产物中筛选对Aβ聚集有抑制效果的药物是耗时耗资的。本研究将Fc标记的KLVFFAE(Aβ自聚集的片段)作为Aβ模型,采用高效液相色谱与电化学检测联用技术(HPLC-electrochemical detection, HPLC-EC)检测了天然产物姜黄素对Fc-KLVFFAE的抑制作用。研究发现：姜黄素可以有效抑制Fc-KLVFFAE的自聚集,并使之保持在可溶的单体状态。HPLC-EC的方法可以用来快速、灵敏地筛选具有电化学活性的Aβ聚集抑制剂。(5)本研究利用荧光、原子力显微镜等技术研究了一种植物提取生物碱——它波宁对Aβ聚集的抑制作用,采用神经母瘤细胞SH-SY5Y研究了它波宁对Aβ聚集物的细胞毒性的抑制作用。研究表明：它波宁可有效的抑制Aβ的自聚集,并可解聚成熟的Aβ纤维；同时,它波宁可抑制Aβ聚集物引起的神经细胞毒性。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
目录  9-12
第一章 绪论  12-25
  1.1 阿尔茨海默病的定义  12-13
  1.2 AD的致病假说  13-15
    1.2.1 乙酰胆碱能异常假说  13
    1.2.2 脑内慢性炎症假说  13-14
    1.2.3 Tau蛋白磷酸化假说  14
    1.2.4 淀粉样假说  14-15
    1.2.5 氧化应激假说  15
  1.3 β-淀粉样多肽  15-17
    1.3.1 Aβ的形成及代谢  15-16
    1.3.2 Aβ的聚集过程  16-17
    1.3.3 Aβ不同聚集物及其细胞毒性  17
  1.4 AD的治疗方法  17-19
    1.4.1 乙酰胆碱酯酶抑制剂  17
    1.4.2 β-折叠阻断肽  17-18
    1.4.3 小分子化合物  18-19
    1.4.4 抗氧化剂  19
  1.5 Aβ与铜离子的络合研究现状  19-20
    1.5.1 Aβ与铜离子的络合位点  19
    1.5.2 Aβ与铜离子的络合常数  19-20
  1.6 帕金森病的定义及病理简述  20-23
  1.7 PD的治疗  23-24
  1.8 本论文的研究背景及意义  24-25
第二章 不同聚集形态Aβ与Cu~(2+)的络合作用研究  25-45
  2.1 引言  25-26
  2.2 实验部分  26-27
    2.2.1 实验试剂  26-27
    2.2.2 实验仪器  27
  2.3 实验过程  27-29
    2.3.1 溶液配制  27
    2.3.2 荧光光谱的测定  27-28
    2.3.3 空间排阻色谱测定Aβ(1-42)的聚集物  28
    2.3.4 原子力显微镜检测  28
    2.3.5 EPR检测  28-29
  2.4 结果  29-39
    2.4.1 Ap(1-16)(Y10W)与Cu~(2+)络合常数的测定  29-31
    2.4.2 Aβ(1-42)单体、寡聚体、纤维前体及纤维混合物的Cu~(2+)络合能力  31-34
    2.4.3 Aβ(1-42)无定形聚集态与Cu~(2+)的K_a~(app)值测定  34-36
    2.4.4 Aβ(1-42)的聚集物可夺取HSA络合的Cu~(2+)  36-39
  2.5 讨论  39-44
  2.6 本章小结  44-45
第三章 RP-IPC-MS法分离检测Fe~(3+)催化的多巴胺的氧化产物  45-53
  3.1 引言  45-46
  3.2 实验部分  46-47
    3.2.1 实验试剂  46-47
    3.2.2 实验仪器  47
  3.3 实验过程  47
    3.3.1 溶液的配制  47
    3.3.2 测试过程  47
  3.4 结果与讨论  47-52
    3.4.1 方法的建立  47-49
    3.4.2 RP-IPC-ESI-MS法检测Fe~(3+)催化的DA的氧化产物  49-52
  3.5 本章小结  52-53
第四章 二茂铁标记的阻断肽与Ap相互作用的动力学研究  53-65
  4.1 引言  53-55
  4.2 实验部分  55
    4.2.1 实验试剂  55
    4.2.2 实验仪器  55
  4.3 实验过程  55-57
    4.3.1 溶液配制  55
    4.3.2 电化学方法  55-56
    4.3.3 空间排阻色谱  56
    4.3.4 原子力显微镜检测  56
    4.3.5 细胞毒性实验  56-57
  4.4 结果与讨论  57-64
  4.5 本章小结  64-65
第五章 快速筛选抑制Aβ聚集药物的电化学方法的建立  65-73
  5.1 引言  65-66
  5.2 实验部分  66-67
    5.2.1 实验试剂  66-67
    5.3.2 实验仪器  67
  5.3 实验过程  67-68
    5.3.1 溶液的配制  67
    5.3.2 电化学方法  67-68
    5.3.3 高效液相分离与化学工作站联用法  68
    5.3.4 原子力显微镜检测  68
  5.4 结果与讨论  68-72
  5.5 本章小结  72-73
第六章 它波宁对Aβ聚集的抑制作用研究  73-80
  6.1 引言  73-74
  6.2 实验部分  74
    6.2.1 实验试剂  74
    6.2.2 实验仪器  74
  6.3 实验过程  74-75
    6.3.1 溶液的配制  74-75
    6.3.2 原子力显微镜检测  75
    6.3.3 ThT荧光法测定Aβ(1-42)的纤维化程度  75
    6.3.4 细胞毒性试验  75
  6.4 结果与讨论  75-79
    6.4.1 它波宁有效抑制Aβ(1-42)纤维的形成并可解聚成熟纤维  75-78
    6.4.2 它波宁抑制Aβ(1-42)聚集物引起的神经细胞毒性  78-79
  6.5 本章小结  79-80
第七章 工作总结与展望  80-82
参考文献  82-108
攻读博士学位期间主要的研究成果  108-110
致谢  110

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学
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