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灭活仙台病毒致PC3细胞凋亡的研究

作　者: 龚孝澄
导　师: 薛整风
学　校: 扬州大学
专　业: 动物学
关键词: 灭活仙台病毒颗粒前列腺癌激素抗性人前列腺癌细胞凋亡
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤,也是引起世界范围内癌症患者死亡的主要原因。患者的前列腺癌细胞首先通过抗原应答产生凋亡,其次耐过凋亡的细胞存活下来,发展成为激素抵抗型。激素抵抗型前列腺癌对多种治疗方式抵抗,如化疗和放疗,最后引起患者死亡。因此,现在急需一种新的方法来治疗激素抗性前列腺癌。研究表明,灭活仙台病毒即日本血凝病毒囊膜(HVJ-E)由于它潜在的溶瘤细胞作用而能诱导肿瘤细胞凋亡,但其分子机制还没完全阐明。本实验,我们开展用HVJ-E来诱导激素抵抗型人前列腺癌细胞(PC3)产生凋亡,并初步探讨其抗瘤机制。首先,我们通过实验观察PC3细胞经HVJ-E作用后RIG-I和IFN-β的表达情况。免疫印迹法和ELISA法检测显示,经HVJ-E处理后,RIG-I的表达增加了,并能诱导IFN-p的产生,且均呈剂量-效应关系。这表明HVJ-E与PC3细胞产生了融合,断裂的病毒基因被RIG-I识别,从而导致PC3细胞中IFN-β的量随HVJ-E的增加而增加。其次,我们观察HVJ-E对PC3细胞繁殖和生长的影响。用HVJ-E处理PC3细胞,观察其形态变化,并通过MTT、流式细胞术、Hoechst33258染色检测经HVJ-E作用后PC3细胞的增殖活性。倒置显微镜观察细胞形态结果显示,经HVJ-E处理的PC3细胞不仅数量减少,细胞还出现皱缩和破裂。MTT法检测结果显示,用50-1000MOI的HVJ-E处理PC3细胞24小时后,PC3细胞的活力与对照组相比下降了,并呈剂量依赖关系。流式细胞检测结果显示,用HVJ-E处理后,PC3细胞产生明显的凋亡,也呈现剂量依赖关系,这表明HVJ-E在PC3细胞中产生了溶瘤作用。用HVJ-E处理PC3细胞后,通过Hoechst33258染色试剂盒可以观察到细胞染色质皱缩,细胞核碎裂。该实验说明HVJ-E具有直接促使PC3细胞凋亡的作用。然后,我们进行实验分析stat1及下游caspase-8, caspase-3和PARP的活性。用HVJ-E处理PC3细胞,Western blot结果显示磷酸化的statl在不同MOI的HVJ-E作用下都能激活,同时,碎裂的caspase-8, caspase-3和PARP在100-1000MOI的HVJ-E作用下也能被检测到。为了进一步确认HVJ-E诱导的PC3细胞凋亡与caspase通路有关,我们在HVJ-E处理细胞前用Jak抑制剂预处理,然后检测碎裂的caspase-3和PARP,同时,对处理的细胞进行凋亡分析及显微镜观察。结果显示,用Jak抑制剂预处理2小时的细胞,磷酸化的stat1,碎裂的caspase-3和PARP被显著抑制且HVJ-E诱导的细胞凋亡和细胞破裂也被显著抑制。该实验说明caspase通路参与HVJ-E诱导的PC3细胞凋亡。接着,我们研究了MAPK和Akt通路在HVJ-E处理后的PC3细胞中的表达情况,通过免疫印迹法使用特定的抗体检测磷酸化的Erk1/2, Jnk, p38MAPK和Akt。结果显示,磷酸化的p38MAPK和磷酸化的Jnk被激活了,而磷酸化的Erk没有检测到。此外,经HVJ-E处理的PC3细胞,其磷酸化的Akt水平没有变化。为了进一步研究MAPK通路对HVJ-E诱导的PC3细胞凋亡的影响,我们分别将p38抑制剂和Jnk抑制剂加到PC3细胞中,30分钟后再加HVJ-E,通过MTT法检测细胞活力。结果显示单独加10μM的p38抑制剂和20μM的Jnk抑制剂不会对细胞的增殖产生影响,而用这两种抑制剂处理细胞24,48,72小时后,HVJ-E对细胞的毒性作用被显著抑制(p<0.05或p<0.01),同时,细胞的显微镜观察也证明了这一点。另外,加入特定的抑制剂后,通过免疫印迹法我们能看到目标通路的失活。以上这些结果表明Jnk和p38MAPK信号通路有助于HVJ-E诱导PC3细胞凋亡。最后,通过BALB/C裸鼠背部皮内接种PC3细胞制作小鼠前列腺癌模型,待瘤体直径达4-6mm时,将荷瘤小鼠随机分组,每组6只,实验组小鼠瘤内注射HVJ-E病毒样粒子,同时设PBS阴性对照组,3天之后重复治疗,连续治疗3次,定期用游标卡尺测量肿瘤体积。治疗结果表明,HVJ-E治疗组小鼠的肿瘤体积显著小于PBS对照组。该实验说明HVJ-E对前列腺癌的生长有明显的抑制作用。

全文目录

中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
符号说明  9-11
文献综述  11-20
  一、前列腺癌研究现状  11-16
    1. 前列腺癌的发病原因  11-12
    2. 激素抗性前列腺癌的发病机制  12-14
    3. 前列腺癌的常规治疗方法  14-16
  二、仙台病毒研究现状  16-17
    1. 仙台病毒基本概述  16-17
    2. 仙台病毒囊膜治疗肿瘤的研究进展  17
  三、IFN-β与细胞凋亡  17-18
  四、Caspase信号通路与细胞凋亡  18
  五、MAPK信号通路与细胞凋亡  18-20
实验内容  20-49
  一、HVJ-E激活RIG-I表达,诱导PC3细胞分泌IFN-β  20-28
    1. 材料  20-21
    2. 方法  21-27
    3. 实验结果  27-28
  二、HVJ-E诱导PC3细胞凋亡  28-34
    1. 材料  28-29
    2. 方法  29-31
    3. 实验结果  31-34
  三、Caspase通路对HVJ-E诱导PC3细胞凋亡的影响  34-38
    1. 材料  34-35
    2. 方法  35-36
    3. 实验结果  36-38
  四、MAPK通路对HVJ-E诱导PC3细胞凋亡的影响  38-44
    1. 材料  38-39
    2. 方法  39-40
    3. 实验结果  40-44
  五、小鼠前列腺癌模型的制备与治疗  44-47
    1. 材料  44
    2. 方法  44-45
    3. 实验结果  45-47
  六、讨论  47-49
全文结论  49-50
参考文献  50-57
致谢  57-58

灭活仙台病毒致PC3细胞凋亡的研究

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