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研究背景：机械压力对于椎间盘组织的合成和分解代谢具有双向调节作用,过度的压力促使椎间盘组织的加速分解,但适当的压力也可通过促进合成代谢而发挥有益的修复作用。然而,通过机械压力和相应阈值对这些生物反应所启动信号转导途径尚未完全阐明。现已明确,椎体软骨终板是椎间盘营养传送、代谢产物排出的必经通道,而终板软骨细胞是正常发挥终板生理功能的物质基础,当椎体终板软骨发生退变,软骨逐渐硬化、钙化,营养代谢产物进出通道功能减弱,则出现椎间盘退变。目前,研究终板软骨细胞均采用常压静态培养,不能准确体现应力负荷强度及持续时间对软骨终板的影响。目前,我们已经开发出一种静水压加载系统,该系统对于体外测试的椎间盘细胞及组织能够进行压力调节、作用时间调节及实验药物干预的特点。我们假设,椎体终板软骨细胞会在不同的压力阈值、作用时间、药物干预下,其分解代谢和合成代谢相关的基因表达会发生相应改变。研究目的：通过体外静水压加载系统所产生的静水压,观察终板软骨细胞生物学特性的变化,检测兔椎体终板软骨细胞在不同压力阈值(0.1MPa,0.7MPa,2MPa,4MPa)、不同作用时间(4小时,24小时)及川芎嗪干预下相关基因表达的作用,探讨静水压及药物干预对椎体终板软骨合成及分解代谢的调节作用,为中医药防治椎间盘退行性疾病寻求新思路。研究方法：1、进行终板软骨细胞分离、培养、传代,进行终板软骨细胞计数,MTT法测定OD值,得出细胞增值率,通过镜下观察及免疫组化方法完成终板软骨细胞形态及功能鉴定。2、通过体外静水压加载系统,将兔椎体终板软骨细胞分别暴露于0.1MPa,0.7MPa,2MPa,4MPa静水压下,作用时间分别为4小时及24小时。依次经过RNA提取、逆转录反应、荧光定量PCR反应分析相关基因表达的差异,包括合成代谢标志物：聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、炎症标志物：诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase iNOS)、环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2COX-2);基质分解代谢标志物：基质金属蛋白酶3(Matrix metalloproteinases-3MMP-3);抗分解代谢标志物：基质金属蛋白酶抑制因子1(Matrix metalloproteinase inhibitor TIMP-1)以及内参基因(GAPDH),探讨不同压力、不同作用时间以及药物川芎嗪对兔椎体终板软骨细胞代谢的调节作用。3、以中药川芎提取物川芎嗪干预体外培养的兔椎体终板软骨细胞,通过体外静水压加载系统达到一定压力阈值(0.7MPa,2MPa,4MPa)及作用时间(4小时,24小时),经荧光定量PCR反应检测相关基因表达的差异：包括炎症标记物iNOS、COX-2、基质分解代谢标志物MMP-3、抗分解代谢标志物TIMP-1及内参基因GAPDH,探讨不同压力、作用时间及中药提取物川芎嗪对兔椎体终板软骨细胞代谢的调节作用。研究结果：1.兔椎体终板软骨细胞在体外单层培养条件下获得良好的生长状态。前4代细胞形态良好,增殖能力强,并且表型表达稳定,属于正常状态软骨细胞。随着传代次数增多会出现“去分化”现象,传第5代时Ⅱ型胶原表达减少,同时细胞增殖能力降低,说明细胞出现老化现象,不宜作为终板软骨细胞研究的对象。2.川芎嗪在不同浓度(0.01g/L、0.02g/L、0.04g/L、0.08g/L、0.16g/L)能不同程度的促进终板软骨细胞的增殖、分化,与空白对照组比较,0.04g/L浓度24小时剂量组的终板软骨细胞增殖数量最多,细胞呈集落样生长,伪足伸出增多,细胞多呈长梭形。3.静水压作用4小时后,随压力上升,合成代谢及炎症因子先升后降；分解及抗分解基因逐渐升高,但是分解基因升高大于抗分解基因,数据总体表现为分解大于合成趋势；加川芎嗪干预后,随压力上升,合成代谢基因逐渐升高,炎症因子、分解及抗分解基因先升后降,在2MPa下达到最高,随后下降,但是分解基因大于抗分解基因的表达,表现出加药有利于合成基因表达的特点。4.静水压作用24小时后,随压力上升,合成代谢及炎症因子先促进后明显抑制；分解及抗分解基因先升后降,但是分解基因升高大于抗分解基因,总体表现为分解大于合成趋势；加川芎嗪干预后,随压力上升,合成代谢、炎症因子、分解代谢及抗分解基因先升后降,在0.7MPa下合成代谢、炎症因子和分解代谢基因达到最高值,表现出加药有利于合成基因表达的特点。5.相同压力(常压)下,随时间延长到24小时,合成代谢表现出先抑制后促进,炎症因子、分解及抗分解代谢表现出均促进；0.7MPa下,随时间延长到24小时,未加药组合成及分解代谢均抑制,加药组合成及分解均促进(TIMPl除外)；2MPa下,随时间延长的24小时,未加药组或加药组合成代谢均弱于分解代谢；4MPa下,随时间延长的24小时,未加药组合成及分解代谢均抑制；加药组合成代谢受抑制,分解和抗分解促进。结论：静水压下各组基因表达在低压短时间下,表现出更多的促进合成及抗分解基因表达,如果施压川芎嗪干预,则表现出促进合成代谢的细胞修复作用。而增加静水压负荷及时间,则表现出更多的分解代谢倾向,这种情况下,即使施加川芎嗪干预,则相关基因表达表现出的细胞保护作用不明显。本实验表明适度施压有利于软骨细胞合成代谢,而持续施加高压则促进分解代谢基因的表达,药物作用有利于细胞修复,通过本实验了解到椎体终板软骨细胞“负荷-时间-药物”相关性,为进一步探索保护终板软骨细胞,调节终板软骨功能提供依据,从而为有效防治椎间盘退变提供新思路。
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