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人脐带间充质干细胞蛛网膜下腔移植治疗脊髓损伤的实验研究

作　者: 高健伟
导　师: 魏开斌
学　校: 泰山医学院
专　业: 外科学
关键词: 人脐带干细胞 流式鉴定 脊髓损伤 模型制作 蛛网膜下腔移植 排斥反应 免疫组化和荧光 神经修复
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


第一部分人脐带间充质干细胞的培养、鉴定、冻存复苏和脊髓损伤模型的建立目的1.探讨人脐带间充质干细胞原代培养方法和鉴定等，观察其生物学特性。2.探讨干细胞爬片培养，GDNF和BDNF荧光表达。3.探讨大鼠损伤脊髓模型的正确建立。方法1.原代细胞培养和流式鉴定1.1获得足月、健康剖腹产产妇的新鲜、无菌的新生儿脐带，提取人脐带华尔通胶或叫沃顿胶（Whartoncs jelly，WJ），行组织贴壁法，应用DMEM/F12进行体外原代培养和传代培养，并对其分离、纯化和鉴定。1.2将脐带华尔通胶剪成约1mm×1mm×1mm大小，行组织贴壁法放置于6孔培养板中，随后把培养板放在37°C温箱中1.5小时进行贴壁。组织贴壁后取出将预制不锈钢网（1mm×1mm大小框径）置于组织块上方，加入DMEM/F12进行培养，观察不锈钢网在培养过程中对细胞数量的影响。1.3采用流式细胞仪检测鉴别CD24、CD34、CD44、CD90在干细胞表面的表达。1.4细胞的冻存和复苏遵循慢冻速融的原则（4℃冰箱30min→-20℃冰箱冷冻室30min→－80℃低温冰箱过夜→-194℃液氮保存。）。细胞培养传代至2代时严格按照步骤原则进行细胞的冻存，储存于液氮中；移植时将其取出复苏，培养传代至第4代细胞进行标记移植。2.人脐带间充质干细胞爬片培养，GDNF和BDNF荧光表达3.脊髓损伤模型的建立3.1Wistar大鼠脊髓损伤模型的建立参照Wamil等制作方法，按落体致伤原理制成一撞击装置，撞击体头端3mm，长度3.5cm，撞击体重量8g，下落高度2cm，撞击体致伤的冲击力8g×3.5cm×2cm。大鼠称重250g左右,10%水合氯醛0.7ml/100g的剂量行腹腔内注射麻醉，将大鼠四肢固定于自制的固定板上。行手术区域碘伏消毒，依次切开暴露脊髓，安装自制打击器，定位T10脊髓上方，按预定方案行脊髓打击伤。所有大鼠脊髓打击模型造模操作及结果均一致，B组、C组、D组、E组术后即刻进行BBB评分均为0.00±0.00，同时观察大鼠神智意识、精神状态、心率、呼吸和四肢活动灵活性，同时观察注射后有无异常不良反应。3.2收集干细胞观察干细胞融合达80%-90%时0.25%胰酶-EDTA消化，离心1000转5分钟，重新加入培养基，显微镜下进行细胞计数，控制在1×106个/ml的浓度，收集备用移植。结果1.脐带华尔通胶（Whartoncs jelly，WJ）组织贴壁法，DMEM/F12体外原代培养7天可见细胞游出，放射状生长，呈菱形或条索状，细胞扁长饱满，集落增殖明显，培养到20天左右可达90%以上融合，细胞最为旺盛；连续细胞传代增殖较快，2-3天细胞融合达90%以上，继续行细胞传代。2.使用不锈钢网贴壁培养，细胞游出明显加快，干细胞数量明显增加，细胞增殖传代时间缩短；对其细胞形态变化无影响。3.流式细胞仪检测干细胞高表达CD44、CD90；不表达或低表达CD24、CD34。4.严格按照遵循慢冻速融的原则（4℃冰箱30min→-20℃冰箱冷冻室30min→-80℃低温冰箱过夜→-194℃液氮保存。）进行细胞的冻存和复苏；复苏后干细胞形态结构、生长状况、增殖情况等与冻存前一致。5.BDNF和GDNF免疫荧光染色在人脐带间充质干细胞中的表达结果显示整个细胞都有明显表达，同个区域分布均匀一致，以胞浆表达最为明显；呈现绿色时，细胞核不明显；呈现棕褐色表达时，细胞核明显可见。6.参照Wamil等制作方法，落体致伤原理制成一撞击装置；按照大鼠脊髓打击造模成功的标准：脊髓打击损伤后可见大鼠后肢及躯体回缩弓背抽动、甩尾，随后弛缓性瘫痪，后肢肌肉完全松弛，B组、C组、D组、E组术后即刻进行BBB评分均为0.00±0.00，说明造模成功。7.造模成功后立即行DMEM/F12和第4代人脐带间充质干细胞注射，分别对B组、C组、D组、E组移植后对大鼠进行神智意识、精神状态、心率、呼吸和四肢活动灵活性等各项指标检查未见异常，注射后未见不良反应。结论1.采用带不锈钢网组织贴壁法，可以获得大量充足的间充质干细胞，可进一步增加细胞数量，提高分离纯化和流式鉴定的特异性。2.在-194℃保存的细胞复苏后同样可以得到形态良好的干细胞。3.人脐带间充质干细胞可明显表达BDNF和GDNF。4.自制打击器打击大鼠脊髓可成功制造大鼠脊髓损伤模型，进行下一步实验。第二部分人脐带间充质干细胞蛛网膜下腔移植治疗脊髓损伤的疗效观察目的探讨蛛网膜下腔移植对损伤脊髓的疗效观察。方法1.随机分组：A组为假手术组：大鼠常规手术进行脊髓暴露，不进行打击损伤，不做任何的移植。B组为单纯DMEM/F12脊髓内局部移植组：大鼠急性脊髓损伤打击模型造模成功后，止血使视野清晰，在距离T10损伤区中心头、尾端2mm处和损伤区域中心两侧共6个点进行DMEM/F12注射；将事先准备好的10μL微量注射器偏离脊髓后正中线0.75mm进针1.5mm，用微量注射器缓慢注入DMEM/F12液体2.5μL，注射时间5min。注射完毕后留针3min，局部止血，依次缝合椎旁肌肉、筋膜、皮肤和皮下组织。C组为DMEM/F12蛛网膜下腔移植组：大鼠急性脊髓损伤打击模型造模成功后，止血使视野清晰，将事先准备好的50μL微量注射器将DMEM/F12液体15μL直接注入蛛网膜下腔，注射时间5min。注射完毕后留针3min，止血，依次缝合椎旁肌肉、筋膜、皮肤和皮下组织。D组为干细胞脊髓内局部移植组：将15μL hUC-MSCs悬液采用与B组相同的方法进行局部脊髓移植。E组为干细胞蛛网膜下腔移植组：将15μL hUC-MSCs悬液采用与C组相同的方法进行蛛网膜下腔移植。2.对大鼠移植后安全性一般情况及死亡情况观察。3.伤后第1d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w进行BBB行为学运动功能评分对比，观察两种途径移植效果。4.伤后1M、2M行免疫荧光染色（GFAP、NSE）观察人脐带间充质干细胞在大鼠脊髓内的迁移和分化情况。5.伤后1M、2M行免疫组织化学染色（GFAP、NSE）观察人脐带间充质干细胞在大鼠脊髓内的表达情况。结果1.一般情况及死亡情况观察A组大鼠术后精神状态、步态、四肢活动能力、疼痛刺激反射等检查无明显异常表现。A组未见死亡的情况，B组、D组与C组、E组死亡情况基本相同。造模成功后大鼠并发症的情况：一般情况下，术后大鼠在2-3小时就可以清醒，4-6小时即可以进少量食物和水。手术后最主要的并发症有：血尿、尿潴留、尿失禁、肺部和尿路感染，还有刀口及椎管感染、肢体水肿、自残等情况。在实验过程中，A组死亡0只，B组死亡3只，C组死亡4只，D组死亡2只，E组死亡3只，存活率为80％。2.术后各时段的BBB计分结果我们通过定期观察大鼠，对各组大鼠进行术后1d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8wBBB评分，观察时间至8W时A组为21.00±0.00，术前术后无变化；B组为8.08±0.56，C组为9.84±1.53，B组、C组结果基本相同，无显著差异；D组为16.58±1.88和E组为18.33±0.79，D组和E组恢复较快，效果明显；与B组、C组比较有显著差异，具有统计学意义(p<0.05)。3. GFAP在脊髓中的表达免疫组化染色1M、2M结果显示：A组中未见阳性表达、B组和C组极少部分存在GFAP弱阳性表达，结果不典型；A组、B组、C组三组比较无明显差异；D组、E组阳性表达明显，GFAP在组织内的表达主要以纵向分布，集中于灰质内，白质内表达结果明显减少；与A组、B组、C组三组比较有明显差异，具有统计学意义。A组、B组、C组三组比较无明显差异，D组、E组荧光染色镜检发现：GFAP表达阳性区域集中在脊髓灰质内，白质内表达较少，阳性表达区域主要呈纵行发展；应用山羊抗兔-FITC抗体，干细胞出现明显的黄绿色荧光，结果有显著表达；滴加山羊抗小鼠-Cy3抗体干细胞出现明显的鲜红色荧光，结果有显著表达；与A组、B组、C组三组比较有明显差异；说明干细胞可以在脊髓损伤部位可以长期存活，荧光表达明显。4. NSE在脊髓中的表达脐带干细胞移植后1M、2M免疫组化染色结果显示D组和E组脊髓损伤区周围NSE阳性细胞比A组、B组、C组明显增多，阳性表达明显。分布情况与GFAP一致，具有统计学意义。D组和E组荧光染色镜检发现：NSE阳性表达区域集中在脊髓灰质内，白质内表达明显减少，阳性表达区域主要呈纵行发展；应用山羊抗兔-FITC抗体，干细胞出现明显的黄绿色荧光，表达结果显著；滴加山羊抗小鼠-Cy3抗体干细胞出现明显的鲜红色荧光，表达结果显著。5. hUC-MSCs在宿主脊髓的迁移和分化D、E两组脐带干细胞移植术后1M、2M镜检，可见干细胞在宿主脊髓内大量存活并且呈纵向迁移，迁移距离已超出所损伤的区域，可以达到更远的距离，损伤区可见大量染色阳性细胞，在灰质内表现最多最为明显，主要集中于此区域，白质内较少阳性表达。通过镜检发现E组内的阳性细胞表达及分布情况比D组更为明显，可能与D组局部移植微环境变化有很大关系；同时未见明显分化。结论1.人脐带间充质干细胞蛛网膜下腔移植对急性脊髓损伤有较好的治疗作用，与髓内局部移植无明显差异，明显好于对照组，差异有统计学意义。2.免疫组化和荧光染色显示人脐带间充质干细胞在宿主脊髓内大量存活并且呈纵向迁移，发挥神经修复作用。3.人脐带间充质干细胞移植安全性高，未发现有明显的排斥反应。

全文目录


中文摘要  4-10
ABSTRACT  10-17
符号说明  17-19
前言  19-22
第一部分 人脐带间充质干细胞的培养、鉴定、冻存复苏和脊髓损伤模型的建立  22-35
  材料与方法  22-31
  结果  31-32
  讨论  32-34
  结论  34-35
第二部分 人脐带间充质干细胞蛛网膜下腔移植治疗脊髓损伤的疗效观察  35-56
  材料和方法  35-44
  结果  44-49
  讨论  49-55
  结论  55-56
全文总结  56-57
附图表Ⅰ  57-58
附图表Ⅱ  58-70
参考文献  70-76
综述  76-86
  参考文献  83-86
致谢  86

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 外科学各论 > 头部及神经外科学 > 脊髓
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