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人乙醛脱氢酶2的表达及其在缓解小鼠急性酒精中毒中的研究
作 者: 黄锟
导 师: 吴元欣
学 校: 武汉工程大学
专 业: 生物化工
关键词: ALDH 表达 优化 动物实验
分类号: R595.6
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 14次
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内容摘要
人乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase2, ALDH2)是乙醇在体内代谢关键酶之一。在醉酒过程中,乙醇代谢产生大量乙醛,通过ALDH的催化分解,可以缓解乙醛对人体的毒害作用。ALDH在体内其他方面的作用正被研究者所了解。本实验主要分为两部分:人ALDH2的克隆与表达;对人醛脱氢酶2进行固定化处理,研究其对缓解小鼠酒精中毒的作用。论文主要结果如下:1、首先构建人ALDH2质粒(pPIC9K-ALDH2),然后用电转导的方法将该质粒电转到毕赤酵母P. pastoris SMD1168中,构建得到基因工程菌株P.pastoris SMD1168(pPIC9K-ALDH2)2、对构建好的菌株发酵条件进行优化,得到了该菌株摇瓶发酵的诱导阶段最佳的工艺条件:在pH=7.0,诱导的初始OD600=12,温度为28℃,诱导过程中,每隔24h补加甲醇的浓度为1.5%(v/v)。在此条件下通过发酵得到的ALDH2的酶活为0.122U/ml。3、通过诱导发酵72h后,收集发酵上清,用Ni2+-亲和层析柱进行分离纯化,获得ALDH2蛋白,以壳聚糖为载体,包埋固定化ALDH2,经冷冻干燥固定化了的ALDH,得到固定化酶粉末。4、用固定化酶粉末和天然产物提取物,在小鼠实验中进一步研究,检测小鼠的醉酒时间和醒酒时间,以及血液和肝脏中谷草转氨酶及谷丙转氨酶的水平,小鼠服用固定化酶粉末后醉酒时间延长,醒酒时间缩短。且转氨酶的水平比没有服固定化酶粉末的小鼠要低。
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全文目录
摘要 4-5 Abstract 5-8 第1章 文献综述 8-24 1.1 人乙醛脱氢酶研究概况 8-19 1.1.1 乙醛脱氢酶的来源与分类 8-9 1.1.2 人乙醛脱氢酶基因研究概况 9-11 1.1.3 人乙醛脱氢酶蛋白研究概况 11-15 1.1.4 乙醛脱氢酶 2 在医学中的研究 15-19 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 19-23 1.2.1 宿主菌株的选择 19-20 1.2.2 表达载体的选择 20-23 1.3 本课题的研究内容 23-24 1.3.1 本研究的研究内容 23 1.3.2 本课题的社会意义和科学意义 23-24 第2章 人 ALDH2 在毕赤酵母 SMD1168 中的表达 24-46 2.1 实验材料 24-27 2.1.1 菌种与质粒 24 2.1.2 主要试剂 24-27 2.1.3 主要仪器 27 2.2 实验方法 27-34 2.2.1 酵母表达载体的构建 27-29 2.2.2 重组毕赤酵母的构建 29-31 2.2.3 工程菌摇瓶发酵表达及检测 31-33 2.2.4 摇瓶诱导表达条件的优化 33-34 2.3 结果与讨论 34-43 2.3.1 质粒 pPIC9K- ALDH2 的构建 34-36 2.3.2 重组酵母菌 SMD1168(pPIC9K- ALDH2)的筛选与鉴定 36-37 2.3.3 蛋白表达 SDS-PAGE 37 2.3.4 诱导表达条件的优化结果 37-43 2.4 小结 43-46 第3章 解酒产品对小鼠酒精解毒的研究 46-54 3.1 实验材料 46-47 3.1.1 实验动物 46 3.1.2 主要试剂 46 3.1.3 主要仪器 46-47 3.2 实验方法 47-52 3.2.1 重组 ALDH2 的纯化 47 3.2.2 重组 ALDH2 的固定化 47-48 3.2.3 解酒产品的制备 48-49 3.2.4 小鼠酒精中毒的预防和治疗实验 49-50 3.2.5 小鼠肝损伤保护实验 50-52 3.3 结果与讨论 52-53 3.3.1 醉酒预防和治疗实验 52 3.3.2 肝损伤保护实验 52-53 3.4 小结 53-54 第4章 结论及建议 54-56 4.1 结论 54 4.2 对后续工作的建议 54-56 参考文献 56-62 攻读硕士期间已发表的论文 62-64 致谢 64
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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 全身性疾病 > 中毒及化学性损害 > 醇中毒
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