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人乙醛脱氢酶2的表达及其在缓解小鼠急性酒精中毒中的研究

作 者: 黄锟
导 师: 吴元欣
学 校: 武汉工程大学
专 业: 生物化工
关键词: ALDH 表达 优化 动物实验
分类号: R595.6
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 14次
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内容摘要


人乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase2, ALDH2)是乙醇在体内代谢关键酶之一。在醉酒过程中,乙醇代谢产生大量乙醛,通过ALDH的催化分解,可以缓解乙醛对人体的毒害作用。ALDH在体内其他方面的作用正被研究者所了解。本实验主要分为两部分:人ALDH2的克隆与表达;对人醛脱氢酶2进行固定化处理,研究其对缓解小鼠酒精中毒的作用。论文主要结果如下:1、首先构建人ALDH2质粒(pPIC9K-ALDH2),然后用电转导的方法将该质粒电转到毕赤酵母P. pastoris SMD1168中,构建得到基因工程菌株P.pastoris SMD1168(pPIC9K-ALDH2)2、对构建好的菌株发酵条件进行优化,得到了该菌株摇瓶发酵的诱导阶段最佳的工艺条件:在pH=7.0,诱导的初始OD600=12,温度为28℃,诱导过程中,每隔24h补加甲醇的浓度为1.5%(v/v)。在此条件下通过发酵得到的ALDH2的酶活为0.122U/ml。3、通过诱导发酵72h后,收集发酵上清,用Ni2+-亲和层析柱进行分离纯化,获得ALDH2蛋白,以壳聚糖为载体,包埋固定化ALDH2,经冷冻干燥固定化了的ALDH,得到固定化酶粉末。4、用固定化酶粉末和天然产物提取物,在小鼠实验中进一步研究,检测小鼠的醉酒时间和醒酒时间,以及血液和肝脏中谷草转氨酶及谷丙转氨酶的水平,小鼠服用固定化酶粉末后醉酒时间延长,醒酒时间缩短。且转氨酶的水平比没有服固定化酶粉末的小鼠要低。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章 文献综述  8-24
  1.1 人乙醛脱氢酶研究概况  8-19
    1.1.1 乙醛脱氢酶的来源与分类  8-9
    1.1.2 人乙醛脱氢酶基因研究概况  9-11
    1.1.3 人乙醛脱氢酶蛋白研究概况  11-15
    1.1.4 乙醛脱氢酶 2 在医学中的研究  15-19
  1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展  19-23
    1.2.1 宿主菌株的选择  19-20
    1.2.2 表达载体的选择  20-23
  1.3 本课题的研究内容  23-24
    1.3.1 本研究的研究内容  23
    1.3.2 本课题的社会意义和科学意义  23-24
第2章 人 ALDH2 在毕赤酵母 SMD1168 中的表达  24-46
  2.1 实验材料  24-27
    2.1.1 菌种与质粒  24
    2.1.2 主要试剂  24-27
    2.1.3 主要仪器  27
  2.2 实验方法  27-34
    2.2.1 酵母表达载体的构建  27-29
    2.2.2 重组毕赤酵母的构建  29-31
    2.2.3 工程菌摇瓶发酵表达及检测  31-33
    2.2.4 摇瓶诱导表达条件的优化  33-34
  2.3 结果与讨论  34-43
    2.3.1 质粒 pPIC9K- ALDH2 的构建  34-36
    2.3.2 重组酵母菌 SMD1168(pPIC9K- ALDH2)的筛选与鉴定  36-37
    2.3.3 蛋白表达 SDS-PAGE  37
    2.3.4 诱导表达条件的优化结果  37-43
  2.4 小结  43-46
第3章 解酒产品对小鼠酒精解毒的研究  46-54
  3.1 实验材料  46-47
    3.1.1 实验动物  46
    3.1.2 主要试剂  46
    3.1.3 主要仪器  46-47
  3.2 实验方法  47-52
    3.2.1 重组 ALDH2 的纯化  47
    3.2.2 重组 ALDH2 的固定化  47-48
    3.2.3 解酒产品的制备  48-49
    3.2.4 小鼠酒精中毒的预防和治疗实验  49-50
    3.2.5 小鼠肝损伤保护实验  50-52
  3.3 结果与讨论  52-53
    3.3.1 醉酒预防和治疗实验  52
    3.3.2 肝损伤保护实验  52-53
  3.4 小结  53-54
第4章 结论及建议  54-56
  4.1 结论  54
  4.2 对后续工作的建议  54-56
参考文献  56-62
攻读硕士期间已发表的论文  62-64
致谢  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 全身性疾病 > 中毒及化学性损害 > 醇中毒
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