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牛源乳铁蛋白促进成骨细胞分化的信号转导机制

作　者: 张伟
导　师: 景浩；任发政；郭慧媛
学　校: 中国农业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 乳铁蛋白成骨细胞分化 p38MAPK LRP1
分类号:
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

乳铁蛋白(Lactoferrin, LF)是一种具有多重生理功能的天然铁结合性糖蛋白,近年来其成骨活性成为了研究热点,然而LF的作用机制尚不明确。本研究在细胞和分子层面,首次对牛LF作用于成骨细胞的信号转导机制进行了研究。本研究利用原代成骨细胞和前成骨细胞系MC3T3-E1,证明了LF可以有效促进分化标志物碱性磷酸酶(ALP)的活性以及骨钙素(OCN)的表达,并且能够提高成骨细胞矿化结节的形成,说明LF对于成骨细胞分化具有全面的促进作用。同时本研究发现,LF促进成骨细胞分化与转录因子Runx2的激活有关。MAPK信号通路是调控成骨细胞分化过程的重要途径。本研究分析了LF刺激下,成骨细胞内MAPK通路的激活及作用。LF刺激MC3T3-E1细胞后,细胞内p38磷酸化水平和激酶活性显著升高,利用通路抑制剂和siRNA基因沉默技术阻断p38MAPK通路后,LF的促分化作用显著降低,同时Runx2的磷酸化也受到显著抑制,说明LF发挥其活性依赖于p38-Runx2通路的激活。另外,LF还能够激活成骨细胞内PKA通路。使用抑制剂阻断PKA通路后,p38通路的激活亦被阻断,并且LF的促分化作用受到显著抑制,说明PKA是位于p38上游的关键靶点,与p38共同介导了LF的信号传导。本研究首次发现p38MAPK信号通路是调控LF促成骨细胞分化的核心途径。为了进一步阐明LF的信号转导途径,本论文研究了LF受体LRP1的作用。通过构建含有LRP1-shRNA干扰序列的pGLV3-LRP1-shRNA载体,并利用慢病毒转染技术,成功建立了稳定沉默LRP1基因的MC3T3-E1细胞模型MC-L4。LF刺激MC-L4细胞后,ALP活性和OCN表达显著增加,与正常细胞中的LF促进效果相同,充分证明了LF受体LRP1并不参与LF对成骨细胞分化的促进过程。此外,本研究还分析了内吞过程对于LF发挥其活性的影响,在抑制内吞条件下,LF依然可以激活PKA-p38通路,证明了LF发挥其促成骨细胞分化活性并不依赖于内吞过程。最后,本研究对MC3T3-E1细胞和LRP1稳定沉默细胞MC-L4,利用抗体芯片技术,分析了LF刺激下两种细胞中53种生长因子表达的情况。LF能够有效促进Thrombospondin-2, Serpin E1, MCP-1, PDGF-AA, Angiogenin, FGF-basic, Cyr61等7种因子的表达；抑制Serpin F1的表达。调控成骨细胞生长因子的表达,可能是LF调控成骨细胞功能的间接方式。综上所述,本研究首次报道了LF促进成骨细胞分化的信号转导机制,发现PKA-p38-Runx2是LF促成骨细胞分化的核心通路,并且LF发挥其活性并不依赖于LRP1受体以及内吞过程。此外,LF还可以促进成骨细胞内多种生长因子的表达,可能通过自分泌或者旁分泌的方式对成骨细胞分化产生影响。本研究不仅填补了LF促成骨细胞分化相关机理研究的空白,也为LF作为预防和治疗骨质疏松症的功能活性物质的开发提供了理论支持。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章绪论  11-29
  1.1 研究背景  11-12
    1.1.1 骨质疏松症的定义及危害  11
    1.1.2 骨质疏松症的治疗  11
    1.1.3 骨骼发育与骨质疏松  11-12
  1.2 文献综述  12-26
    1.2.1 骨重建与成骨细胞生成  12-15
    1.2.2 乳铁蛋白的分布、结构及功能  15-17
    1.2.3 乳铁蛋白成骨活性的研究现状  17-20
    1.2.4 乳铁蛋白成骨活性机理  20-22
    1.2.5 MAPK信号通路在成骨细胞分化中的作用  22-24
    1.2.6 乳铁蛋白受体及其功能  24-26
  1.3 立题依据及研究意义  26-27
    1.3.1 立题依据  26
    1.3.2 研究意义  26-27
  1.4 研究内容  27-28
    1.4.1 乳铁蛋白促进成骨细胞分化及成熟  27
    1.4.2 MAPK信号通路在乳铁蛋白促分化过程中的作用  27
    1.4.3 LRP1受体以及内吞过程在乳铁蛋白促成骨细胞分化过程中的作用  27
    1.4.4 乳铁蛋白对成骨细胞生长因子产生的影响  27-28
  1.5 技术路线  28-29
第二章乳铁蛋白促进成骨细胞分化的研究  29-43
  2.1 前言  29
  2.2 材料与方法  29-36
    2.2.1 主要仪器与设备  29-30
    2.2.2 主要试剂与材料  30-31
    2.2.3 主要溶液的配制  31-32
    2.2.4 实验方法  32-36
  2.3 实验结果与分析  36-41
    2.3.1 原代成骨细胞鉴定  36-37
    2.3.2 乳铁蛋白对成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的影响  37-38
    2.3.3 乳铁蛋白对成骨细胞骨钙素(OCN)的影响  38-39
    2.3.4 乳铁蛋白对成骨细胞矿化的影响  39-40
    2.3.5 乳铁蛋白对成骨细胞转录因子Runx2的影响  40-41
  2.4 讨论  41-42
    2.4.1 乳铁蛋白促进成骨细胞分化标志物的表达和矿化  41-42
    2.4.2 乳铁蛋白促进成骨细胞转录因子Runx2的活性  42
  2.5 小结  42-43
第三章 MAPK信号通路在乳铁蛋白促进成骨细胞分化过程中的作用  43-59
  3.1 前言  43
  3.2 材料与方法  43-46
    3.2.1 主要仪器与设备  43
    3.2.2 主要试剂与材料  43-44
    3.2.3 主要溶液的配制  44
    3.2.4 实验方法  44-46
  3.3 实验结果与分析  46-55
    3.3.1 乳铁蛋白对成骨细胞内MAPK信号通路激活的影响  46-47
    3.3.2 乳铁蛋白通过p38 MAPK信号转导通路促进成骨细胞分化  47-49
    3.3.3 siRNA基因沉默技术确定p38 MAPK信号通路的作用  49-51
    3.3.4 乳铁蛋白激活成骨细胞内p38 MAPK的作用方式  51-52
    3.3.5 Wnt、TGF-β、EGFR、PKA信号通路在乳铁蛋白促成骨细胞分化过程中的作用  52-53
    3.3.6 PKA通路与p38共同介导乳铁蛋白对成骨细胞分化的作用  53-54
    3.3.7 PKA是位于p38上游的关键激酶,共同传导乳铁蛋白刺激信号  54-55
  3.4 讨论  55-58
    3.4.1 乳铁蛋白通过p38通路调控成骨细胞分化过程  56
    3.4.2 乳铁蛋白通过p38 MAPK激活骨核心转录因子Runx2  56-57
    3.4.3 PKA与p38的交互作用以及可能的中间途径  57
    3.4.4 其他可能参与乳铁蛋白促成骨细胞分化的途径  57-58
  3.5 小结  58-59
第四章 LRP1受体以及内吞过程对乳铁蛋白促进成骨细胞分化的影响  59-75
  4.1 前言  59
  4.2 材料与方法  59-64
    4.2.1 主要仪器与设备  59-60
    4.2.2 主要试剂与材料  60
    4.2.3 主要溶液的配制  60
    4.2.4 实验方法  60-64
  4.3 实验结果与分析  64-73
    4.3.1 慢病毒载体的构建和测序鉴定  65-66
    4.3.2 慢病毒滴度测定  66
    4.3.3 嘌呤霉素最小致死浓度筛选  66-67
    4.3.4 LRP1-shRNA慢病毒在MC3T3-E1细胞中的侵染效率  67
    4.3.5 MC3T3-E1细胞中慢病毒介导的稳定沉默效率  67-68
    4.3.6 稳定沉默LRP1对乳铁蛋白促成骨细胞分化的影响  68-69
    4.3.7 LRP1受体天然拮抗剂RAP对乳铁蛋白促成骨细胞分化的影响  69-70
    4.3.8 乳铁蛋白对其可能受体在MC3T3-E1细胞中表达的影响  70
    4.3.9 激光共聚焦显微镜观察乳铁蛋白的内吞情况  70-72
    4.3.10 沉默LRP1受体对乳铁蛋白内吞的影响  72
    4.3.11 抑制内吞对乳铁蛋白激活p38、PKA通路的影响  72-73
  4.4 讨论  73-74
  4.5 本章小结  74-75
第五章乳铁蛋白对成骨细胞生长因子产生的影响  75-85
  5.1 前言  75
  5.2 材料与方法  75-77
    5.2.1 主要仪器与设备  75
    5.2.2 主要试剂与材料  75
    5.2.3 主要溶液的配制  75-76
    5.2.4 实验方法  76-77
  5.3 实验结果与分析  77-82
    5.3.1 乳铁蛋白样品中内毒素含量测定  77-78
    5.3.2 乳铁蛋白处理对成骨细胞生长因子产生的影响  78-82
  5.4 讨论  82-84
  5.5 本章小结  84-85
第六章全文结论与展望  85-88
  6.1 全文结论  85-86
  6.2 论文的创新点  86-87
  6.3 展望  87-88
参考文献  88-95
致谢  95-96
附录  96-97
个人简介  97

牛源乳铁蛋白促进成骨细胞分化的信号转导机制

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